英文题目：Single cell and spatial transcriptomics in human tendon disease indicate dysregulated immune homeostasis
发表杂志：Annals of the Rheumatic Diseases
影响因子：19.104
研究背景
肌腱病，包括以疼痛和功能受限为特征的多因素肌腱疾病仍然是肌肉骨骼医学的重大疑难问题。最近的研究结果强调了免疫介导机制在肌腱疾病中的关键作用，印证了通常与炎症性风湿病和肌肉骨骼疾病 (RMD) 相关的关键的免疫学和生物力学因素，在肌腱中也会表现出来。单细胞技术(scRNAseq) 越来越多地应用于风湿病学，以识别驱动疾病发病机制的关键细胞表型。尽管在小细胞数量和异质肌腱活检方面做出了努力，仍然没有详细的空间肌腱细胞图谱预知转化目标。因此本文利用scRNAseq和空间转录组（ST）强强联合，进行细胞间相互作用分析以构建动态细胞微环境的图谱，驱动人类慢性肌腱疾病的发展。
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实验材料
收集接受肩关节手术的肩袖撕裂患者的冈上肌和肌腱标本，只有在术前MRI扫描中没有发现肩胛下肌腱病变，或关节镜检查时肩胛下肌腱的大面积损伤时，才纳入患者。
患者入组条件：
1) 有肩痛和功能障碍病史
2) 患肩没有做过手术
3) X线照片无肩膀骨折
4) 无类风湿性关节炎或骨关节炎病史
常规前交叉韧带(ACL)重建时获得的健康肌腱(腘绳肌腱)作为独立对照组。（在其他体外肌腱研究中，通常也使用腘绳肌腱作为与病变肩腱比较的替代对照。）
实验方法
10x Genomics单细胞转录组、10x Genomics 空间转录组
冈上肌和肌腱样本信息
研究结果
在健康（4例活检组织，n=3040 细胞）和患病（5例活检组织，n=19084 细胞）肌腱中，发现同时存在内皮细胞、免疫细胞和基质细胞（图 1A）。每个细胞类型都存在于疾病和健康组织中，但具有不同的定量和定性特征。在基质细胞中鉴定到了一种“壁画型”基质细胞（图 1B）。包含有周皮细胞的壁细胞，可能是肌腱中的祖细胞；有趣的是，这些细胞在表型上与类风湿性关节炎 (RA) 滑膜中NOTCH3高壁细胞相似，后者可以在通过JAG1与内皮细胞 (EC) 相互作用分化为成纤维细胞。
图1 健康和患病人肌腱的细胞组成和相互作用 A-D
(A) 使用正常（n=4，人腘绳肌腱）和患病（肌腱病，n=5，人冈上肌腱）人肌腱用于单细胞分析。UMAP展示了具有标记基因的内皮细胞、免疫细胞、基质肌腱细胞和基质壁细胞。(B) 肌腱的基质细胞：壁肌腱细胞 (mT)、正常肌腱细胞 1 (nT1)、正常肌腱细胞 2 (nT2)、患病肌腱细胞 1 (dT1)、患病肌腱细胞 2 (dT2)、患病肌腱细胞 3 (dT3) 和患病循环肌腱细胞 (dTc)。(C) 肌腱的免疫细胞：树突状细胞 (DC)、巨噬细胞 1 (Macro1)、巨噬细胞 2 (Macro2)、循环巨噬细胞 (Macro-C)、T-Cells1 (T-Cell1) 和 T-Cells2 (T-Cell2)。(D) 肌腱的内皮细胞 (EC)：CD36 high EC (CD36EC)、E-Selectin EC (CD62eEC)、胶原 4 血管 EC (COL4aEC)、免疫样 EC (ImmuneEC)、LYVE1 阳性 EC (LYVE1EC) 和 SEMA3G 阳性 EC (SEMA3GEC)。
细胞间相互作用和ST分析表明类似的现象可能也会肌腱病的壁细胞和SEMA3G ECs之间发生（图1F）。在所有患病的基质细胞群中，细胞外基质蛋白基因（例如COL1A1、COL3A1、FN1、BGN）表达量更高，这被认为是肌腱病的标志性特征（图S2B）。此外，通路分析表明基质细胞簇从对正常肌腱中免疫细胞和细胞因子反应的负调节（图S3A），转变为促进免疫细胞募集和激活，同时伴随有患病肌腱中细胞因子分泌和反应过程的状态（图S3B，C）。
图2 健康和患病人肌腱的细胞组成和相互作用 E-F
(E) 肌腱中的肌腱细胞-免疫细胞相互作用（n = 3 健康，4 患病）。来自健康（粉红色）和患病（绿色）肌腱的肌腱基质细胞中APP和MIF表达的小提琴图。正常人肌腱中基质APP和巨噬细胞LYVE1 的空间表达可视化，和患者肌腱中的基质MIF和巨噬细胞CD74空间表达可视化，方框突出显示了共表达区域。在来自健康（粉红色）和患病（绿色）肌腱的免疫细胞中LYVE1和CD74表达 的小提琴图。Biorender 信息图总结了肌腱疾病中肌腱细胞-免疫细胞的相互作用。(F) 肌腱中的EC-肌腱细胞相互作用。
单细胞转录组数据发现了7种PECAM1 + ECs亚型（图 1D），包括一种能产生CCL21的LYVE1 + ECs，并发现该亚群可以调节树突细胞 (DC) 迁移。另外结果显示CCL21在肌腱病患者的这些细胞中上调（图 S2C）。DC 包含有正常肌腱中的最大免疫细胞群（图 1B）。有趣的是，DC 也存在于患病的肌腱中，但是却表现出更高水平的 DC 激活和更低水平的C1Q基因（调节性 DC 标记物）（S2D）。通过进一步分析差异上调基因的通路富集，证实肌腱病患者中 DC 的激活以及随后的T细胞也被激活（图 S3D，E）。这种激活部分原因可能是由于基质蛋白表达的增加，例如FN1，它可以激活 DC 并导致组织内 T 细胞群的改变，这可能有助于驱动疾病发展慢性化的机制。
图S2
此外，在患者肌腱中发现了三个巨噬细胞群，其中之一就是循环巨噬细胞（图 1C，图 S2A)，这类细胞群是患病组织所独有的。正常肌腱中巨噬细胞的转录图谱分析最类似于组织修复和碎片清除（图 1E，图 S2D）。在正常肌腱内发现APP在肌腱细胞中表达，这可以诱导巨噬细胞中促进表型的分解。然而，在患者的基质中APP 的表达降低，这与患病组织巨噬细胞内LYVE1 的表达降低相吻合（图 1E，图 S2D）。这些巨噬细胞亚群与RA缓解有关。
进一步的证据表明基质环境可能诱发炎症变化，包括MIF在患者肌腱细胞中表达增加（图 1E，图 S2B），然后可以通过其受体CD74诱导促炎作用，CD74在患者肌腱的巨噬细胞中表达上调（图 1E ，图 S2C )。
图S3
从细胞间相互作用分析产生ST指示性数据表明基质诱导免疫调节。因此假设肌腱内免疫区室的主要作用是调节和解决损伤；然而随着微创伤的累积，肌腱细胞发起的碎片去除和基质修复的基本过程可能导致免疫区室阳性扩增。进一步提出，在患者肌腱内，免疫稳态可能变得不平衡，激活的免疫细胞由内皮细胞和基质细胞引发，促进炎症循环和异常组织修复。炎症环境，包括在这个初步肌腱图谱中明确证明的细胞因子通路，在一系列炎症性RMDs中产生有效的免疫干预。最值得关注的是在人类肌腱疾病中定位和研究这些通路的潜力。
参考文章：
Akbar M, MacDonald L, Crowe LAN, et al. Single cell and spatial transcriptomics in human tendon disease indicate dysregulated immune homeostasis [published online ahead of print, 2021 May 17]. Ann Rheum Dis. 2021;annrheumdis-2021-220256.
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