2021年8月，百迈客和中国医科大学合作文章“Identification of Target PTEN-Based miR-425 and miR-576 as Potential Diagnostic and Immunotherapeutic Biomarkers of Colorectal Cancer With Liver Metastasis”发表于期刊Frontiers in Oncology（IF：6.244）。其中转录组数据差异及功能分析等使用百迈客云平台完成，此外百迈客业务还包括单细胞转录组、空间转录组、单细胞ATAC&GEX、单细胞免疫组库等等，有兴趣的老师可以联系当地销售。
结直肠癌（CRC）是最常见和致命的癌症之一，其主要并发症是继发性肝转移。这种患者临床应用的生物标志物非常少导致该病仍无法治愈。近年来越来越多的研究表明，肿瘤的发生和发展与免疫逃逸密切相关，提示免疫相关指标在结直肠癌肝转移（CRLM）中的作用过去可能被忽视。作者揭示了升高的miR-425和miR-576通过抑制PTEN介导的细胞免疫功能促进CRLM。基于GSE81581和GSE44121数据集，相比于原发性CRC组织miR-425和miR-576在CRLM中显著上调。此外，作者还确定了两个miRNA参与抑制肿瘤转移相关的P53和TGF-β信号通路，均缩短了转移易感性患者的总生存期。值得注意的是对配对的CRC组织进行原位杂交，不仅证实了miR-425和miR-576的表达在CRLM中显著上调，而且还揭示了它们与肿瘤恶化尤其是肝转移密切相关。此外，作者进一步证实了miR-425和miR-576联合使用是一种有效的肝转移和不良临床结局的模型。机制方面，PTEN下调被证实是miR-425和miR-576作为肝转移相关癌基因的共同靶点，由于在CRLM中存在结合位点和协调抑制P53/TGF-β信号通路，通过分子学实验在CRC细胞中进一步证实。重要的是靶蛋白PTEN与微卫星不稳定性、肿瘤微环境和免疫细胞浸润密切相关。因此，作者推测miR-425和miR-576是CRLM预防和免疫治疗的新生物标志物，也是PTEN-P53/TGF-β功能轴的上游抑制剂。
英文题目：Identification of Target PTEN-Based miR-425 and miR-576 as Potential Diagnostic and Immunotherapeutic Biomarkers of Colorectal Cancer With Liver Metastasis
中 文 题 目：基于靶蛋白PTEN的miR-425和miR-576作为大肠癌肝转移的潜在诊断和免疫治疗标志物的鉴定
期 刊：Frontiers in Oncology
IF：6.244
发表时间：2021.8
合作单位：中国医科大学
研究背景
结直肠癌是西方第三大常见癌症也是全球主要的死亡原因。超过一半的低肿瘤淋巴结转移（TNM）的CRC患者在诊断时通常在3年内发生转移，这表明迫切需要有效的生物标志物来评估易感性。近年来，研究CRLM的靶点特别是miRNAs的研究并不缺乏，但能应用于临床实践的靶点很少，包括免疫治疗，这是一种新兴的癌症治疗策略。10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）是一种肿瘤抑制因子，与许多癌症的恶性进展密切相关如CRLM。值得注意的是近期一项研究发现，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p共同靶向PTEN，从而促进CRLM的发生。然而，很少有人关注miR-576-3p与PTEN之间的调控关系。
材料方法
试验材料：157例CRC患者癌组织和癌旁组织，其中29例为继发性肝转移患者。
试验方法：TCGA和GEO数据库中的RNA-seq数据、TMA和ISH试验、细胞转染试验、qPCR、WB等。
研究结果
1、高水平的miR-425和miR-576与CRLM相关
为了探索促进CRLM进展的重要miRNA，作者分析了来自GSE81581 （n = 8）队列的数据，揭示了CRLM与原发性结直肠癌组织之间的miRNA失调，其中207个miRNA上调，20个miRNA下调（图1A）。MiRNA-425和miRNA-576在CRLM中显著上调（图1B）。此外，作者研究了miRNA-425和miRNA-576共同发挥的转移相关作用，通过KEGG分析发现P53和TGF-β信号通路显著富集（图1C）。值得注意的是，miR-425和miR-576的高表达缩短了CD4+或II期直肠腺癌（READ）患者的总生存时间，这两者都与CRC转移密切相关（图1D）。
为了验证这两种miRNA的差异表达，作者收集了157例CRC患者癌组织及癌旁组织。TMA和ISH试验显示，与对照相比miR-425和miR-576在CRC患者中高表达尤其是肝转移患者（图1E和F）。ROC曲线计算miR-425和miR-576基于肝转移及其他相关危险因素线下面积，初步确定其在CRLM中的可信诊断能力（图1G）。
图1高水平的miR-425和miR-576与CRLM相关
2、miR-425和miR-576表达与CRLM相关临床变量的相关性
为了探讨miR-425和miR-576在CRLM患者中的临床价值，作者分析了miR-425和miR-576与环境因素或病理变量包括年龄、性别、家族史、T分期、样本量、肠道占位、分化、血管浸润、原发部位和肝转移。频率分布和校正后的回归分析显示，miR-425和miR-576高表达均在肝转移患者组织中频繁分布（图2A）。此外，miR-425过表达与CRC患者晚期T期、肠道占位、分化程度和原发性直肠相关（图2B）。增加miRNA的表达是渗透到浆膜和广泛占用肠道的一个促进因素（图2C）。
MDR分析显示，miR-425、miR-576与家族病史、分化程度、原发部位联合使用是评估肝转移风险的最佳预测模型，其交叉验证一致性（CVC）最高，预测误差最小（表1）。这些结果提示miR-425和miR-576高水平的CRC患者特别容易发生肝转移。
图2 miR-425和miR-576表达与CRLM相关临床变量的相关性
3、miR-425、miR-576表达对CRLM患者预后的影响
总之，系统生存分析显示，miR-425高表达的患者总生存期和无病生存期较差，miR-576高表达的患者也是如此（图3A）。结果首先证明miR-425和miR-576高表达与肝转移患者的OS和DFS关系更为显著（图3B）。如预期，由miR-425和miR-576组成的双因素模型可以有效预测OS状态（表2），而miR-425和miR-576的T分期和分化程度是评估DFS风险的最佳模型（表3）。重要的是，通过计算风险评分，作者进一步验证了miR-425和miR-576的组合在晚期CRC和CRLM中是一个较好的预后预测因子具有较高的敏感性（图3C-H）。这些结果表明，高水平的双miRNA标记常常预示着CRC的预后不良尤其是CRLM。
图3 miR-425和miR-576对结直肠癌肝转移患者预后的影响
4、PTEN被鉴定为促进CRLM的miR-425和miR-576的靶点
为了阐明miR-425和miR-576介导肝转移和不良预后的有意义的下游靶点，作者在GSE81558 （n = 6）数据集上绘制火山图，分析CRC组织和癌旁组织之间的DEGs（图4A）。PTEN是CRLM中显著下调基因与miR-425和miR-576靶基因的交集（图4B）。聚类热图显示在CRLM中PTEN的下调最显著（图4C）。进一步检索STRING发现与PTEN互作的关键蛋白（图4D）。配对序列间的有效MFEs分别为−20.8和−16.1 kcal/mol（图4E）。进一步分析发现，基于TCGA数据库PTEN在几种类型的肿瘤中表达显著下调（图4F），PTEN表达越低易发生肿瘤转移且预后越差（图4G和H）。此外，基于GSE62321 （n = 26）数据集，PTEN与miR-425和miR-576一致，证实PTEN正向参与P53、TGF-β信号通路，在肿瘤转移中发挥有意义的作用（图4I）。这些结果表明，PTEN下调是CRLM中miR-425和miR-576的共同靶点，导致临床结果不佳。
图4 PTEN被鉴定为促进CRLM的miR-425和miR-576的靶点
5、miR-425和miR-576通过抑制PTEN-P53/TGF-b轴对CRC细胞肿瘤转移的影响
接下来，作者证明了miR-425和miR-576通过负调控PTEN-P53/TGF-β轴，在细胞学水平上通过敲低和过表达功能实验确定了其诱导CRC转移的发生。QPCR检测发现，在HCT116和SW480细胞系中，这两种miRNA的过表达均导致PTEN mRNA表达明显抑制（图5A）。MiR-425和miR-576的缺失显著增强了PTEN mRNA的表达（图5B）。WB试验证实PTEN蛋白的变化一致，P53和TGF-β也是如此（图5C和D）。正如预期的那样，结果显示miR-425和miR-576显著抑制WT荧光素酶基因表达强度，然而在Mut基因上没有观察到明显的变化表明PTEN 3’UTR与miR-425和miR-576之间存在直接的结合模式（图5E）。此外miR-425和miR-576的高表达显著促进了HCT116和SW480细胞的迁移能力分，反之亦然（图5F-I）。综上所述，miR-425和miR-576直接靶向PTEN介导的P53/TGF-β信号通路，参与了CRLM过程中细胞迁移的促进。
图5 miR-425和miR-576通过抑制PTEN-P53/TGF-β轴对CRC细胞肿瘤转移的影响
6、CRLM中miR-425/miR-576-PTEN轴的免疫分析
为了进一步研究miR-425和miR-576在CRLM发生和发育的免疫调节中的重要作用，作者首先分析了miR-425和miR-576与相关指标的相关性。因此，miR-425在CRC进展中与免疫检测点密切相关，如CD160、CD200R1和CD80及免疫通路包括CD65自然杀伤细胞和单核细胞（图6A）。MiR-425与检测点和通路存在显著相关性（图6B）。此外，作者进一步发现肿瘤抑制因子PTEN与MSI、TME、免疫细胞浸润呈正相关，从免疫的角度阐明了PTEN对CRLM的调控作用（图6C-E）。以上结果表明，miR-425/ miR-576介导的PTEN抑制通过触发免疫逃逸促进CRLM过程。
图6 miR-425/miR-576和PTEN对CRLM的免疫分析
研究结论
综上所述，miR-425和miR-576的升高与肿瘤发生和更坏的结果有关，并负向参与了CRLM中PTEN-P53/ TGF-β免疫功能轴。因此，作者的工作有助于更好地了解miRNA-mRNA的潜在应用，为在CRLM预防和免疫治疗中寻找潜在的生物标志物和靶点提供即时线索。
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