文献解读 | 单细胞多组学在急性淋巴细胞白血病研究上的应用 |

发布于 2021年9月6日

百迈客单细胞转录组产品介绍

百迈客单细胞转录组测序产品基于10x Genomics Chromium系统利用8通道的微流体 “双十字”交叉系统和油滴包裹技术，在单细胞水平进行高通量基因表达谱检测，对复杂细胞群深入分析，表征单个细胞的表达谱，避免单个细胞的异质性生物学信息被大量细胞的均质化覆盖。通过单细胞转录组，可鉴定细胞群、细胞亚群、筛选细胞群特有marker基因，并完成对细胞分化轨迹的追踪，从而解析细胞异质性和发育轨迹。

导读

背景：骨髓内B细胞的分化具有严格的调控网络协调，这个基因调控网络中的遗传物质的变异是急性淋巴细胞白血病（ALL）出现的基础，例如ETV6-RUNX1融合基因的出现会导致细胞分化停滞。本研究旨在分析沿B细胞谱系分化轨迹的转录因子活性，作为表征白血病骨髓中异常细胞状态的参考，并确定维持癌症特异性细胞状态的转录因子，以进行更√确的治疗。

方法：使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析正常的B细胞谱系分化和体内细胞状态。

结果：从骨髓scRNA-seq中发现的淋巴样细胞转录因子活性与前期ATAC和ChIP-seq数据高度一致。使用这种调节B细胞谱系分化的调节因子作为综合参考，本研究对ETV6-RUNX1融合基因阳性的ALL病例的分析揭示了白血病细胞中多种ETS转录因子的活性升高，包括白血病全基因组关联研究中ELK3。基因表达变化与白血病免疫微环境中的自然杀伤细胞失活和耗竭有关。此外，结果表明诊断时细胞周期在G1期的细胞越丰富，诱导化疗期间缺乏分化相关的调节网络变化，这两个特点代表了化疗耐药的特征。为了靶向白血病调节程序，克服治疗耐药性，本研究表明抑制ETS转录因子会降低细胞活力。

结论：本研究提供了表征正常和白血病骨髓中B细胞谱系分化中转录因子活性的详细图谱，并为针对白血病免疫微环境和调节网络的新治疗策略提供了基础。

实验方法

材料：急性淋巴细胞白血病（ALL）初诊和化疗15天的骨髓样本（BM）

方法：单细胞转录组测序、ATAC-seq、CHIP-seq、转录组测序

研究结果

1、在单细胞转录组中捕获骨髓B细胞谱系分化轨迹

从具有11个cluster的HSC中分离出B细胞用于进一步分析（图 1a），DNA转移酶（DNTT，也称为 TdT）和MME（也称为CD10）基因区分早期淋巴祖细胞（LP，cluster 3），它们进展为表达CD19和G1期pro-B细胞状态（图 1b）。此外，3个pre-B细胞cluster（缺乏DNTT表达）在图谱上分离。pre-B II和未成熟B细胞簇由MS4A1（CD20）定义。拟时序分析如图1c所示。基于此分析的细胞状态之间的进展与指定的分化阶段一致。这些细胞状态注释也与使用流式分选B细胞群评分高度一致（图 1d）。然而，这些由大量转录组定义的基因组仅在循环细胞状态中得分很高。因此，本研究还从单细胞分析中区分了每个cluster的marker基因，以研究BM中B细胞谱系细胞状态的分配。为了验证，本研究选了两个独立的BM数据集：分别是健康的成人捐赠者和三个儿童BM样本。从这两种分析中，可以重现观察到的B细胞谱的连续性。为了描绘表征早期B细胞谱系分化中细胞状态转变的基因表达变化，本研究沿着伪时间轨迹（HSC→LP→pro-B→pre-B→未成熟 B 细胞状态）依次比较了细胞cluster。使用scDD区分了2201个基因的mRNA变化、平均表达的差异和模式，并且HCA和儿童BM之间具有高度的一致性。基于RNA速度分析该基因组的RNA动力学，进一步解析了B细胞谱系的细胞状态（图 1e）。在该分析中，剪接和未剪接计数均用于评估基因表达变化的速度，从而通过基因调控动态扩展细胞状态表征。这由首先上调的 DNTT（图 1f）说明这些细胞周期状态和细胞周期中mRNA水平的变化（图1g）。

图1 骨髓scRNA-seq中分离的B淋巴样细胞分化状态

2、TF活性变化揭示了B细胞分化的调控动态

沿B细胞谱系轨迹的细胞状态转换受TF严格控制。为了表征TF、共调节因子（CR）、染色质修饰（CM）和剪接/转录复合物（ST）的活动，使用在训练集和测试集中可重复识别的TF作为线性模型拟合分析细胞状态的重要预测因子。B细胞谱系分化阶段的TF活性评分如图2a所示。主要调节B细胞谱系循环的TF的表达水平见图2b。EBF1、FOXO1、LEF1和TCF4与ETS因子ERG和FLI1一起在pro-B细胞中显示出*高的活性（红色），而TCF3和PAX5在pro-B细胞和pre-B细胞中的活性都相似。SPIB和IRF4活性在pre-B细胞中升高；一些已知的具有抑制功能的TF，如BCL11A和已知的协同抑制复合成分HDAC2 和TBL1XR1，它们与糖皮质激素受体相互作用以促进终末分化。

作为独立验证，首先从pro-B细胞中检索了大量ATAC-seq数据，显著富集的TF motif证实了与pro-B G1期细胞相关的9个TF（EBF1、FOXO1、TCF3、RFX5、IRF1、TCF4、LEF1、ERG、FLI1）（图 2c）。pro-B活性TF在儿童BM数据集中也具有高度相似的活性谱（图 2d）。接下来，分析了包括TF与目标基因表达相关性，以及每个目标基因位点的TF motif。根据发现集中找到的TF，在训练/测试集中预测它们的靶基因。为了测试预测的靶基因是否受TF调控，本研究检索了PAX5、EBF1和BCL11A的ChIP-seq数据，这些数据在人类细胞系模型 Nalm-6中可用，使用GREA T获得与基因关联的peak。对于PAX5和EBF1，超过75%的预测目标具有ChIP-seq peak关联（图 2e）。ATAC-seq motif富集与基于ChIP-seq的TF靶基因位点验证，结果高度一致，证明TF活性评分反映了调节作用。说明本研究对健康人BM单细胞转录组的分析为基因表达和TF活性变化提供了全面的参考，这些变化表征了单细胞分辨率下早期B细胞谱系分化的特征。

图2 调节B细胞谱系分化的转录因子活性

3、E/R白血病细胞类似于pro-B细胞状态，并在细胞周期活动中表现出异质性

为了表征ALL（E/R）中常见的TF融合的白血病细胞，本研究对6个儿童E/R+ pre-B-ALL病例进行了scRNA-seq，收集6个诊断期和2个诱导化疗第15天的BM样本（图 3a）。基于DNTT表达及其与正常BM细胞类型的明确分离，确定了每个供体中的白血病细胞簇（图 3b）。基于B细胞谱系簇特异性基因集，发现诊断时白血病母细胞类似于pro-B分化状态（图 3c）。该分析同样将pro-B细胞鉴定为*接近的正常分化状态，这与之前的研究一致。细胞周期状态在不同情况下不同，ALL3中的循环细胞比例*低，ALL9中的*高比例（图 3d）。对于具有中期诱导治疗的2个病例（ALL10 和 ALL12），在第15天收集的样本中细胞分离为不同的细胞状态（图 3a、d），表明治疗进一步改变了白血病细胞状态。

通过分别比较循环和G1期细胞与正常pro-B细胞的基因表达分布，进一步表征诊断时E/R白血病细胞与pro-B细胞的不同。该分析是基于HCA健康人BM和儿童BM pro-B细胞进行的。对于大多数基因，正常B细胞谱系分化时*显著的变化是ZP指标，该指标捕获感兴趣基因计数为零的细胞部分，例如前50个上调和下调的基因在 pro-B到pre-B中的过渡。因此，本研究使用ZP对来自HCA的E/R+和pro-B细胞的G1期和循环细胞状态比较中发现的272个上调和90个下调基因进行聚类（图 3e）。与沿B细胞谱系分化轨迹的其他细胞状态相比，大约1/3的上调基因在 E/R+ 细胞（cluter 4）中处于*高水平，而cluter 1、2、5 和 6 中的基因在白血病和正常干/祖细胞中表达（图 3e）。一小部分（19 个基因，cluter 8）在正常的未成熟 B 细胞中高度表达，并且发现16个基因仅与小儿BM相比具有显著性。考虑到一些基因表达模式类似于pre-B 细胞状态，但白血病细胞似乎停滞在pro-B状态，因此进一步确定了在pro-B到pre-B过渡中通常受调节的基因，发现其他基因与分化停滞有关。总的来说，在过渡到pre-B状态时正常上调的 97 个基因保持在与正常 pro-B 细胞相似的低水平，而在分化过程中下调的145个基因在白血病细胞中仍然表达。

通路富集分析显示，一些上调基因与细胞因子、趋化因子和生长因子通路相关，特别是那些参与NK细胞介导的细胞毒性负调节的基因。之前在ALL中的一项研究表明，免疫逃避中 TGF-β增加。因此，与E/R+ G1期细胞向pro-B G1期细胞的表达分布相比，TGFB1和有助于降低NK细胞募集和激活的3个基因LY6E、TERF2和HLA-E上调表达（图 3f）。

图3 E/R+细胞与正常pro-B细胞的比较

4、E/R+ BM免疫微环境中NK细胞的丰度和活性较低

对BM免疫细胞进一步分析，发现与HCA BM供体相比，E/R+ BM中的GNLY或NKG7阳性NK细胞数量显著减少（图 4a）。此外，根据流式细胞分离数据，淋巴细胞中的NK细胞计数在E/R+与非E/R pre-B-ALL中*低（p=0.025）。

为了进一步表征免疫细胞群，将HCA和E/R+ ALL供体的T细胞和NK细胞汇集在一起进行联合分析。基于聚类和marker基因分析，可以区分几种不同的NK细胞类型（图 4b、c）。筛选表达GNLY或NKG7的cluster（cluster 0、2、3、7、10、11、16），发现与来自HCA供体的NK细胞相比，来自ALL BM的NK细胞被随机分配给这些cluster（图 4d）。具体来说，所有NK细胞主要代表cluster 10和16，它们与表达未成熟CD56bright 和过渡NK细胞的颗粒酶 K（GZMK）相匹配（图 4e 中的基因组评分代表来自scRNA-seq研究的NK亚型）。相比之下，大多数正常 BM NK细胞代表表达颗粒酶 B（GZMB）和穿孔素（PRF1）的成熟或终末NK细胞（cluster 0）。因此，E/R+白血病细胞可能会主动逃避NK细胞的细胞毒性，然而，NK类型的频率因供体而异（图 4f）。高表达IFNG的cluster 7几乎完全对应于HCA供体 3，而与其他ALL病例相比，细胞周期高度活跃的ALL8和ALL9更类似于正常BM中的成熟或活性NK细胞谱。总之，白血病细胞状态与正常pro-B分化状态的不同之处在于干/祖细胞特异性基因和几种免疫调节基因的高表达。免疫调节基因的变化反映为E/R+ BM内更多不成熟的NK细胞类型。

图4 E/R+骨髓中的NK细胞数量和活性较低

5、白血病调节程序揭示了 TF 活动中的细胞状态和白血病相关风险基因

为了进一步破译有助于将E/R+白血病细胞与正常淋巴细胞状态区分开的异常TF活性，本研究重复了TF活性分析（图 5a）。2/3通过线性模型拟合的TF（R2 > 0.5）在pro-B细胞中有活性，在E/R+细胞中活性升高，包括ETS因子（ELK3、ERG、FLI1）、FOXO1、MAX、MAZ 、SP4、TCF4和THAP11。分析还揭示了RFX5和NFYC在 E/R+原始细胞中的高活性，通常仅在未成熟的B细胞状态下达到峰值。此外，E/R+细胞中活性下降的TF包括 RUNX1、SPIB、TCF3 和 IRF4（图 5a）。

基于bulk RNA分析可以验证它们在B-ALL中的表达，在E/R+亚型（红色箭头）中检测到的比例*高，如在t-SNE图上比较血液系统恶性肿瘤所示（图 5b），其中恶性淋巴瘤在图上突出显示。两种常见的B-ALL亚型（E/R+和高超二倍体病例）显示出类似的高ELK3，而升高的SP4则更具 E/R 特异性，进一步分析了E/R+细胞中的这些TF基因座（图 5c）。本研究使用GRO-seq对E/R+ BM中的新生转录进行了分析，揭示了Pol2参与编码和非编码区的主动起始和延伸。GRO-seq 证实了这些基因位点在 E/R+细胞中的转录活性（图 5c）。此外，还揭示了ELK3上游未注释（Refseq、UCSC 或 Gencode）的转录起始位点（TSS）（图 5c）。两个lncRNA库在该基因组区域内具有匹配的转录本，但注释之间的一致性很差。因此，在E/R+ BM（n = 8，scRNA-seq 和 GRO-seq 分析中的匹配样本）中使用配对的bulk RNA-seq 进一步检测了该基因座内的剪接模式。带注释的ELK3转录本具有来自剪接点跨越reads的支持，而上游转录本与lncRNA结构*匹配（图 5c）。

图5 E/R+白血病细胞中的TF活性

6、化疗期间持续存在的白血病TF为克服耐药性提供了新的靶点

基于在ALL10和ALL12中诱导治疗中期获得的scRNA-seq谱分析了标准白血病诱导治疗（泼尼松龙、长春新碱、多柔比星）对 TF表达的影响（图 5d）。基于差异分布分析，与两个样本中的诊断时状态相比，来自第15天骨髓的残余白血病母细胞具有较低的RUNX1、TCF3、SOX4和ERG表达，而SMAD1和ELK3水平略有增加。在第29天诱导结束时，ALL10的原始细胞减少（0.08%）。在第15天，pre/未成熟B TFs POU2F2、KLF2/6、AFF3和SPIB在ALL10的剩余白血病细胞（10%原始细胞）中的表达升高。这些变化可能与糖皮质激素的分化诱导作用有关。但总体而言，TF活性或基因表达的变化不大，表明尽管成熟CD20（由MS4A1编码）增加，但仅可能发生向pre-B细胞状态的部分分化。相比之下，ALL3和ALL12对治疗的反应缓慢（第 15 天的原始细胞率为74%和59%；诱导结束时分别为0.16%和0.2%）。ALL3与其他E/R+病例相比，诊断时细胞周期状态分布强烈偏向G0/G1状态（图 3d），这可能是对靶向分裂细胞的药物（阿霉素/长春新碱）耐药的基础。ALL12第15天TF谱表明白血病基因调控程序的持续性，表现为缺乏pre-/未成熟B TF上调（图 5d）。

总结

该研究首次全面表征了E/R+ ALL病例中的细胞状态和TF 活性，并将其与单细胞分辨率下的正常人类 B细胞谱系分化进行了比较，进一步证明了使用单细胞基因组学监测早期治疗反应的可行性及其发现新治疗靶点的潜力。通过对单细胞和大量基因组数据的联合分析，表征了导致白血病细胞异常细胞表型的TF谱。这些结果可以为开发针对白血病免疫细胞串扰和治疗抗性白血病细胞状态的新疗法提供合理的依据。

原文下载链接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33218352

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