空间转录组+基因组数据联合分析揭示乳腺原位癌的异质性

文章题目：Genomic profiling reveals heterogeneous populations of ductal carcinoma in situ of the breast

中文题目：基因组分析揭示乳腺原位癌的异质性群体

期刊：Communications Biology

影响因子：6.6

DOI：10.1038/s42003-021-01959-9

导读

对大部分患者来说，乳腺导管原位癌（DCIS）不会发展为浸润性导管癌，在当前的临床标准下，这些患者经常被过度治疗。虽然有各种候选标记物可用，但尚未建立用于描述风险类别的相关标记物。在本研究中，作者分析了431例DCIS患者的临床特征，并对21例患者进行了全外显子组测序分析，对72例患者进行了靶向深度测序分析。确定了年龄<45岁、HER2扩增和GATA3突变可能影响复发。PIK3CA突变阴性和PgR阴性也被认为是危险因素。空间转录组分析进一步显示GATA3功能障碍上调上皮-间充质转化和血管生成，随后PgR下调。这些结果揭示了DCIS中异质细胞群的存在，并为DCIS分类和优化治疗提供了预测性标记。

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方法

外显子组文库构建和全外显子组测序

从21例DCIS（原发性肿瘤）患者和4例IDC（复发性肿瘤）患者中选择福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本。同时对每位患者制作相应的冰冻切片，染色确定DCIS和正常上皮组织中的区域。

全外显子组测序中基因组风险因子的选择

为了提高基于临床评估区分低风险和高风险DCI标准的准确性，作者尝试识别基因组因素。评估了21例DCIS患者，他们是随机选择的，具有匹配的固有亚型和相对较高的复发率。对匹配的正常乳腺组织进行测序（平均深度×109.1），以区分体细胞突变的种系变异。获得的变异图如图1a所示。

GATA3和PIK3CA突变是队列中最常见的突变，分别出现在4例（19%）和5例（24%）患者中。在4例GATA3突变患者中，3例出现IDC复发。GATA3突变阳性与GATA3突变阴性复发的优势比（OR）为5.5（95%CI=0.63–76.7）。为了进一步研究GATA3突变在复发中的意义，对复发肿瘤患者的样本进行额外分析，以确定与配对原发性DCI相比的突变状态。

结果

全外显子靶向测序

获得的突变图如图2所示。总共有40名（56%）和36名（50%）患者分别携带GATA3和PIK3CA突变。与上述结果一致，GATA3突变与复发呈正相关（OR=7.8；95%CI=1.17~88.4），而PIK3CA突变往往与复发呈负相关（OR=0.45；95%可信区间=0.12~1.7）。在测试的180个基因中，没有一个比这两个因素更能作为预测标记。对于PgR蛋白表达，低PgR表达再次与复发相关（OR=25.6；95%可信区间=3.64–142.2）。结果表明在11例中的8例中发现了GATA3突变，尽管ER阳性，但PgR较低。

DCIS患者的分子解剖分析

为了确定所识别的高危标记物的分子病因，调查了另外三名具有代表性的新鲜冰冻标本患者。患者A患有带有GATA3突变（图2，*1）和微侵袭的DCIS，病变被认为是真正的DCIS。患者B患有PgR低表达的DCIS（图2，*2）和微侵袭，病变被视为真正的DCIS。患者C患有PIK3CA突变的DCIS（图2，*3），没有任何微侵袭，病变被认为可能是假DCIS（低风险DCIS）。

含有GATA3突变的DCIS病变的STseq

首先，利用空间转录组学技术——10X基因组学Visium平台，通过STseq分析了患者A标本的空间基因表达。该患者在术前病理诊断中被诊断为DCIS，但在术后病理诊断中发现有微侵袭部位。因此，DCIS病变被确定为IDC的真正前兆。平均深度为×2391.4的面板测序分析显示该样本含有GATA3突变（外显子4:c.865dupG:p。C288fs，变异等位基因频率[VAF]=7%）。在较高的VAF（外显子5:c.T1035A:p。N345K，VAF=26.1%），表明新出现的GATA3突变用PIK3CA突变覆盖了DCIS的基本特征。

PgR低表达但无GATA3突变的DCIS病变的STseq

接下来，作者将患者B作为PgR低表达的例外患者进行研究，尽管没有GATA3突变（图2，*2）。从平均深度×3030.6的靶向测序中，检测到PIK3CA突变（外显子21:c.A3140T:p。H1047L，VAF=40%），而即使在这个足够的测序深度，也没有检测到GATA3突变。因此，从分子水平来看，该患者的预后良好。然而，术后病理检查显示微侵袭，表明DCIS病变是IDC的真正前兆。免疫组化分析显示该患者ER阳性，PgR阴性。

DCIS和PIK3CA突变

最后，将患者C的病例分析为可能的假DCIS病例，不太可能发展为IDC（低风险DCIS）。该患者特征为PIK3CA突变，GATA3突变或下调缺失，无微侵袭，术后无复发。该患者的DCIS病变包含两个PIK3CA突变（外显子10:c.G1633A:p。E545K，外显子10:c.A1634G:p。E545G，两种突变的VAF=25%）。

对于Visium分析，收集了799133428个测序读数，测序饱和度为86.2%。分析点的数量（直径55µm）为2043个，其中包含7469个唯一分子标识符（UMI）读数的中位数和每个点2928个检测基因的中位数。如图3A的中间板所示，癌细胞斑点被分为三组，通过非分层k-均值聚类（K＝9），表明DCIS病变中存在异质性。此外，可能代表癌细胞周围微环境的非癌点被分为四类。在代表病理学鉴定的癌细胞的总共422个点中，通过分析Visium读数在46个点中检测到GATA3突变读数（图3b）。幸运的是，在该患者中，GATA3突变位于转录本的3′端，因此可以通过Visium读数来表示。为了研究携带GATA3突变（spots）的细胞是否是克隆性的，检测了46个携带GATA3突变的点的VISUM读数上的GATA3突变位点。突变完全存在于同一位点（外显子4:c.865dupG:p。C288fs），表明它们是单克隆来源。使用TCC R检测了GATA3突变的斑点之间的差异表达基因（DEG）。总共检测到1468个DEG（错误发现率[FDR]<0.05，图3c，左面板）。如图1d所示，在具有GATA3突变的斑点中观察到PgR表达下调（P=0.02901；t检验；图3c，右面板）。为了预测检测到的DEG的功能结果，使用Metascape进行了路径分析(http://metascape.org/)28.发现了9条与11种癌症特征相关的关键途径。

与突变阴性点的结果相比，GATA3突变的癌点受影响（图3d）。特别是，关键基因和关键途径包括EMT和血管生成。重要的是，具有表达变化的关键基因是那些被鉴定为对异常GATA3功能作出反应的基因，如VIM和FN1（图3e）。这些结果表明GATA3突变在DCIS进展过程中出现，并伴有恶性特征。据报道，增加的VIM表达发生在管腔癌细胞的GATA3突变下游24；因此，在这些斑点中观察到的GATA3突变可能代表恶性发展过程中先前的基因改变。相反，在没有GATA3突变的斑点中，DEG主要富集于雌激素反应、紧密连接和mTORC1的信号通路，表明这些斑点中的细胞获得了允许细胞转化的最小变化。

Visium分析发现了异质基因表达，这取决于癌区和非癌区细胞的位置。PgR表达下调，尽管观察到高ER表达（图4a，上图），与免疫染色结果一致（图4a，下图）。针对DCIS细胞中基因表达的变化，手动选择了188个位于导管内区域的形态学斑点。这些斑点的无监督分层聚类确定了三个明显的聚类（图4b，左面板）。在空间上，不同的簇对应于不同的区域（图4b，中间面板）。重要的是，簇1的48个斑点（红色）与DCIS细胞的位置重叠，DCIS细胞根据其形态即将入侵（由图4b右面板中的红色箭头指示）。同时，簇2（有色绿色）的101个斑点位于同一导管的中心，并被视为不侵入基质的细胞（由图4B的中间板中的绿色斑点指示）。簇1和簇2之间的差异表达分析确定了2747个DEG（FDR<0.05，图4c，左）。有趣的是，GATA3表达在簇1中显著下调（图4c，右图）。尽管该基因未发生突变，但该患者的GATA3功能异常可能发生在基因水平。根据基因富集和通路分析的结果，该患者始终观察到以GATA3为中心的基因表达变化，如患者A所观察到的（图4d，e）。共有21条途径和18个癌症特征，包括EMT和血管生成途径受到影响。如对患者A所观察到的，在未侵入间质的第2组中，DEG主要代表雌激素反应相关基因。总之，在这名患者身上，我们得出结论，GATA3通过其表达的变化发挥关键作用。即使没有基因组突变，GATA3的异常表达也可能在某些患者中导致相同的结果。

通过全外显子组测序，平均深度为×134.8。Visium分析揭示了一种单调的基因表达模式，与该癌的形态学单克隆结构一致（图5a，左面板）。事实上，这些斑点通过非层次聚类大致分为两个簇（图5a，中间和右侧面板）。它们几乎与形态学确定的癌细胞和非癌细胞（基质细胞）完全重叠。因此，使用DEG分析比较了癌细胞中的347个斑点（蓝色斑点）和基质细胞中的151个斑点（橙色斑点），并确定了癌斑点中508个上调的DEG（FDR<0.05）。加权基因共表达网络分析（WGCNA）显示，与非癌点相比，癌点中只有两个主要节点（模块）发生改变（图5b，上面板）。进行了子网络分析，以确定枢纽基因（图5b，中间和下部面板）。hub基因的途径富集分析显示，参与雌激素反应和p53途径的基因在模块1中富集（图5c，补充数据5），这与在患者A和B中观察到的良性出现斑点的特征相同，表明该病变中没有发生恶性转化。

讨论

在本研究中，将GATA3突变确定为DCI分类的潜在标记。ER阳性DCIS患者的PIK3CA突变阴性和PgR蛋白阴性也被认为是危险因素。传统的临床病理因素对于预测IDC发生的风险也至关重要，包括年龄(≥45岁与<45岁）和HER2状态（阴性与阳性）。在缺乏HER2靶向治疗的情况下，HER2扩增是众所周知的IDC预后不良因素。然而，HER2扩增的频率在DCIS和IDC33–37之间有所不同，HER2扩增是否是DCIS的风险因素仍有争议。HER2阳性率/年龄的HR≥45岁与2岁消极/年龄≥45年为1.54（95%可信区间=0.31-7.65，P=0.595）。HER2阴性/年龄<45岁与HER2阴性/年龄的HR比较≥45为2.43（95%可信区间=0.78-7.52，P=0.125）。相反，HER2阳性/年龄<45岁与HER2阴性/年龄的HR≥45为11.03（95%可信区间=3.54-34.4，P<0.0001）。尽管交互试验的P值为0.121，但这些结果可能表明年龄与HER2扩增之间存在交互作用。还发现PIK3CA突变的DCIS细胞没有任何导致恶性转化的基因组或转录组改变。未来，DCIS的临床研究(包括正在进行的试验12 14)可能会提供一种准确的算法，使用包括本研究提出的标记物在内的标志物来区分高风险和低风险DCIS，从而避免不必要的治疗。

参考文献

Nagasawa S, Kuze Y, Maeda I, et al. Genomic profiling reveals heterogeneous populations of ductal carcinoma in situ of the breast. Commun Biol. 2021 Apr 1;4(1):438.

 

文献下载

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33795819

 

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