心脏是第一个发育完整的功能器官,对胚胎发育至关重要。心脏发生涉及来自多个谱系的异质性细胞群,它们在时空上相互作用,以驱动心脏的发育。心脏发育过程中细胞类型的异质性使得利用传统的发育生物学技术研究心脏变得困难。虽然单细胞RNA测序(scRNA-seq)已被用于研究心脏发育中涉及的细胞机制,但是它不能保存空间信息,也不能研究细胞分化和形态发生之间复杂的相互作用。在这里,作者结合空间和高通量单细胞数据来研究鸡胚胎心脏发育的时空相互作用和调控机制。百迈客不仅提供单细胞系列产品,6大核心产品,单细胞转录组、空间转录组、单细胞免疫组库、单细胞ATAC-seq、单细胞核转录组、单细胞全长转录组,而且实现了单细胞转录组、空间转录组百迈客云端APP分析,深入大数据挖掘,一键快速分析,单细胞和空间转录组的联合分析近似实现单细胞分辨率的空间异质性,助您进入时空组学研究新时代。接下来我们来看看作者如何实现单细胞转录组和空间转录组数据联合研究鸡的心脏发育过程。

英文题目:Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis

中文题目:时空单细胞RNA测序确定了鸡心脏发育过程中细胞分化和形态发生之间的相互作用

期刊名称:Nature Communications

影响因子:14.919

原文链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7979764/

材料方法

4个阶段的鸡卵;scRNA-seq;stRNA-seq;smFISH;Immunohistochemistry

结果

1、胚胎鸡心脏发育的空间解析单细胞转录组学调查

        为了研究心脏发育过程中分化和形态发生之间复杂的相互作用,作者结合了单细胞和空间转录组学,分析了鸡心脏Hamburger-Hamilton心室发育的四个关键阶段。最终生成了22315个细胞的单细胞转录组数据和覆盖6800多个spots的空间转录组数据。
        通过对单细胞数据进行降维、聚类及可视化分析,最终确定了15个不同的心肌细胞类型簇。除了心肌细胞类型,作者还检测到少量的红细胞、巨噬细胞和树突状细胞,并发现了一个独特的异质性细胞群,该细胞能高水平表达beta-4 (TMSB4X)。对空间转录组数据的独立分析确定了具有差异转录程序的解剖区域。将空间转录组数据与单细胞数据进行整合,作者构建了所有心肌细胞类型对的接近图,并将其可视化为弦图(图1e)。研究发现心肌细胞在第7天与心内膜细胞共定位,在第10天和第14天与血管内皮细胞和成纤维细胞共定位,这是可预料的,因为在第7天,心内膜细胞排列在小梁状心肌中,而在第10天,血管内皮细胞和成纤维细胞出现在致密心肌中。  
2、心脏谱系的空间解析
        作者收集并重组了来自心外膜、心内膜和心肌谱系的单细胞转录组,然后重建谱系分化轨迹。通过对上皮细胞(TCF21+ ,WT1+, TEK−)、间充质细胞(TCF21+ ,TEK−)、成纤维细胞(TCF21+ ,POSTN+ ,TEK−)和壁细胞进行心外膜谱系分析,发现了一个丰富的时空分化过程。对来自心室游离壁的5621个心外膜细胞簇进行分析,识别出五个主要细胞簇:一个早期心外膜祖细胞簇(C1),两个中间前体细胞簇(C2和C3),一个成纤维细胞簇(C4)和一个壁细胞簇(C5)。

        其中,细胞集群C1主要是来源于HH24(第四天)心室和心外膜祖细胞,并发现了与心外膜发育相关的维甲酸信号转导的生长因子MDK。细胞簇(C2和C3) 主要出现在EMT的HH31(第7天)阶段。C2簇表达于胚胎心脏最外层的心外膜,主要为TCF21+、WT1+、TBX18+,并使MDK表达上调。C3细胞群以TBX18−和WT1−为主,高水平的表达了与细胞迁移有关的细胞外基质转录本,上调了EMT调节因子SNAI1的表达。将细胞类型标记转移到空间数据表明,在第7天和第10天心脏分期中,只有上皮细胞(心外膜亚簇C1和C2)在空间上局限于心室壁最外层的心外膜层。然而,在第7天,表间质(心外膜C3亚簇)在空间上并不局限于心外膜外层,这表明它们驻留在心肌而不是心外膜外层。  
到第10天(HH36)时,成纤维细胞(C4)表达COL3A1和DCN,壁细胞(C5)表达ACTA2、MYH11、TAGLN和RGS5。然而,此时心外膜最外层的一些细胞仍然保持中间未分化表型。到第14天(HH40)时,大多数心外膜层细胞已分化为成纤维细胞,这是由其定位到第14天心外膜所提示的,而其他成纤维细胞和壁细胞如预期的一样定位于整个心肌。轨迹重建证实了第7天的分支细胞发育以及第10天的分支合并和分化(图2c)。在第7天和第10天发现了显著的分期变异性,在心外膜内层存在未分化细胞,而在心肌中存在分化细胞(图2d)。

       为了支持心外膜谱系的结果,作者在第7天(HH31)心脏切片上进行了smFISH实验。smFISH的结果验证了scRNA-seq和空间RNA-seq的结果,并与这些细胞群来自心外膜谱系的可能性的结果相一致。   

3时空上解决了心脏组织发育过程中局部细胞异质性

         为了研究胚胎心室的空间转录差异,作者对空间数据进行了聚类,并根据其在组织中的位置对聚类进行解剖区域标记。 通过分析,作者识别出心室、心房、瓣膜和流出道的不同空间簇,也识别出心室区域的不同层,包括心外膜、心肌致密区、小梁区以及心内膜。
         为了检测区域特异性标记,作者在各个阶段对解剖区域进行了差异基因表达分析。在第7天和第10天发现了左右心室的转录差异。这些差异在第14 天心脏发育完成时减小。与右侧相比,左心室中TBX5的表达显著富集,并且这种差异随着第7天至第14天的分期而降低(图3d)。从第7天开始,CHGB的表达主要局限于右心室,ACTG2在第7天表达于右心室(图3f和3g)。TBX5明确了左右心室腔室的位置,并已被证明在发育中的鸡的左心室中富集。Takeuchi等人的报道的在右心室特异性表达的TBX20,在空间转录组数据中并没有得到证实(图3e)。从第7天到第14天的scRNA-seq数据集没有捕捉到TBX5、 ACTG2CHGB在心室中表达的显著差异,尽管它们似乎确实倾向于在其拟心室的的细胞中高表达。 smFISH证实了TBX5在左心室小梁心肌细胞中上调,并这种富集随着发育阶段而减少(图3i)。smFISH实验也进一步证实了 TBX20在不同阶段的左、右心室的表达水平非常低(图3i)。同时还发现,肌红蛋白(MB)的表达在空间上局限于后期发展的致密心肌层,这表明心肌细胞向更成熟的表型转化,需要更大的氧气(图3h)。考虑局部细胞类型组成,发现MB的上调是由于不成熟肌细胞增加和肌细胞疏松心肌中MB表达增加的结果造成的(图3b)。相反,NPPB基因在空间上局限于形成小梁状心肌层,如预期的一样。作者进一步探索了空间数据集,以确定先天性心脏缺陷(CHD)相关基因表达的时空模式。在50多个人类基因中,显性功能的突变丧失已被发现与冠心病有关。这些基因在发育过程中,通过以高度特定的时空模式表达调控水平来预测在冠心病中,基因型和表型之间可能存在很强的相关性。对CHD相关基因进行了空间RNA-seq分析,发现关键转录因子如GATA5的表达在瓣膜区域富集,IRX4的表达局限于心室组织,TBX5在左心室富集(图4a-b和图3d)。PITX2基因是早期中胚层的主要调控因子,也是决定器官的关键成分,在心脏左侧富集(图4c)。冠心病相关肌体蛋白编码基因如ACTC1GJA5在心房和心室组织中表达丰富,而MYH7仅局限于心房(图4d-f)。 
4. 胸腺素beta-4在冠状血管细胞中持续富集
       
        通过对scRNA-seq聚类分析,鉴定出一个富含TMSB4X的异质性细胞簇,包含来自所有四个发育阶段的细胞(图1b)。TMSB4X编码beta-4,这是一种众所周知的多效性分泌小肽,在肌动蛋白-细胞骨架组织、细胞运动、存活和分化中起着重要作用。为了深入研究了TMSB4X细胞表型的异质性及其转录谱,作者将1075个TMSB4X细胞重新聚类,并检查其细胞类型组成(图5a)。结果发现簇1主要由表达TCF21 的心外膜细胞和表达心内膜标记物的IRX6NPC2的心内膜细胞组成(图5a,右)。簇2主要由差异表达的ACTA2的血管壁细胞组成(图5a,右)。簇3主要由差异性表达FABP5和 TM4SF18的冠状血管内皮细胞组成(图5a,右)。stRNA-seq数据表明,在后期阶段,TMSB4X在瓣膜和心室壁中富集。对scRNA-seq数据的进一步分析发现,在发育阶段,beta-4表达略有增加,在冠状血管内皮细胞亚簇2中beta-4表达最高。差异基因表达分析发现,与细胞骨架组织相关的基因 VIMRHOAACTB、 ACTG1DSTN 显著上调(图5b)。此外,研究还发现了被beta-4激活的钙结合蛋白CALM1和 CALM2的上调,两种蛋白与细胞周期进展、增殖和信号转导有关。总的来说,TMSB4X可以增强细胞骨架组织活性和钙信号。
       
        为了进一步确定beta-4的具体类型,作者进行了smFISH 和免疫组化实验。结果表明,在第4 天 ( HH24)时,beta-4 mRNA在心外膜和心内膜中表达最高。在第7天( HH31)时,beta-4 mRNA在冠状血管内皮细胞中的表达最高。在第10天(HH36)时,beta -4 在 CDH5+ 血管内皮细胞和周围的壁细胞(CDH5-PDGFRB+)中表达最高。在第14天(HH40)时, TMSB4X 在 CDH5+ 血管内皮细胞中表达仍然较高,而在 PDGFRB+ CDH5-壁细胞中表达较低。免疫组化进一步证实了这些发现。总之,结合空间分辨率的转录组学和影像学数据显示,TMSB4X 在所有细胞类型中普遍表达,但在冠状动脉细胞中富集,从冠状动脉血管发育的开始,到心室发育过程中冠状动脉血管的成熟。

总结

        作者将单细胞和空间转录组学结合起来,以高时空分辨率探索了鸡心脏的早期发育阶段,构建了一个具有单细胞和空间分辨率的基因表达谱系,揭示了几种调控机制,并证明了scRNA-seq和stRNA-seq可以用于研究细胞分化和形态发生之间的相互作用,实现高分辨率空间转录组研究空间基因表达异质性,甚至空间细胞异质性,单细胞和空间转录组学技术将会在更多的领域发挥着越来越重要的应用。

 

参考文献

Mantri M, Scuderi GJ, Abedini-Nassab R, et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 2021 Mar 19;12(1):1771.

 

 

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