分类： 医学研究
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2019年11月2日Nat Cell Biol杂志在线发表了题为“Mitochondria-localised ZNFX1 functions as a dsRNA sensor to initiate antiviral responses through MAVS”的文章，该文章由中山大学生命科学学院徐安龙教授团队完成，其中RNA-seq部分由百迈客协助完成，详细情况如下：

英文题目：Mitochondria-localised ZNFX1 functions as a dsRNA sensor to initiate antiviral responses through MAVS

中文题目：线粒体定位的ZNFX1充当dsRNA传感器通过MAVS启动抗病毒反应

发表杂志：Nature Cell Biology，2019

影响因子：17.728

合作单位：中山大学生命科学学院

小编悄悄告诉您，近期百迈客医学的高分合作文章不少，趁着年前陆续解读给各位fans，咱们也看看人家是如何设计文章思路的。

 

研究背景

过去的二十年的研究表明，属于解旋酶超家族2（SF2）的DExD/H-bo解旋酶在抗病毒先天免疫中起着至关重要的作用。但是，与SF2共享一个保守的解旋酶核心(两个串联的RecA域组成，具有ATPase活性和RNA结合能力)的解旋酶SF1的抗病毒功能鲜为人知。

病毒衍生的核酸与胞质病毒传感器结合后，可以募集两个配体MAVS和STING来诱导I型干扰素(IFN)的产生以及许多具有抗病毒活性的干扰素刺激基因（ Interferon Stimulated Genes,ISG）。这些ISGs在多种抗病毒免疫水平上发挥着多种功能，比如ISGs可抑制特定的病毒生命周期阶段，此外，某些ISGs还可以增强先天病原体的识别能力或积极调节IFN信号传导。

研究目的：

确定很少研究的解旋酶SF1的抗病毒功能并鉴定更多ISGs。

研究方法

已发表数据重新挖掘：水疱性口炎病毒（VSV）感染的人单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）的IVT-SAPAS（in vitro transcription-sequencing alternative polyadenylation sites）时间梯度数据，筛选新的可能基因–包含ZNFX1。
关键基因抗病毒作用验证：1）敲减关键基因表达，VSV-eGFP感染检测这些基因的抗病毒活性–初步证实ZNFX1参与抗病毒反应；2）qRT-PCR或免疫印迹分析VSV感染或干扰素诱导剂聚肌胞苷酸(poly(I:C))刺激各细胞系或小鼠后组织中ZNFX1表达改变；3）病毒感染公共数据挖掘，感染后ZNFX1表达上调；

ZNFX1为干扰素刺激基因ISG验证：人重组IFN-α和IFN-β孵育实验、JAK1抑制剂鲁索替尼(ruxolitinib)、Ifnar1敲除后qRT-PCR和免疫印迹分析ZNFX1表达水平；转录因子预测及转录因子motif缺失和WT报告基因试验证实其病毒感染后的上调取决于JAK1-STAT1级联反应。

体外和在体实验证明ZNFX1抗RNA病毒天然免疫调控作用：A549、L929细胞、293T细胞、小鼠等siRNA沉默或Crispr-cas9敲除VSV感染实验，ZNFX1过表达和对照组A549细胞转录组测序分析其影响的信号通路。

ZNFX1与IFN信号传导：ZNFX1过表达质粒和Ifnb1-reporter或IFN刺激的应答元件（ISRE）报告质粒瞬时转染A549细胞进行萤光素酶报告基因分析，然后进行或不进行VSV感染，等实验证实ZNFX1通过诱导I型IFN的产生而参与抗病毒免疫反应，其抗病毒特性也取决于IFN信号传导。

ZNFX1与病毒RNA结合：pulldown实验和RIP-seq等；

ZNFX1线粒体定位以及互作的IFN产生相关adaptor分析：不同组分分离WB、显微共聚焦实验、Co-IP实验、线粒体组分分离及蛋白酶保护测定等；poly(I:C)处理与否的Rig-I-/-A549细胞RNA-seq，空载EV、ZNFX1过表达、EV+poly(I:C)、ZNFX1+poly(I:C)，共计4组；等

 

研究结果

1、病毒感染诱导ZNFX1表达

作者首先分析了他们先前发表的被水疱性口炎病毒（VSV）感染的单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）的IVT-SAPAS（in vitro transcription-sequencing alternative polyadenylation sites）数据，并发现了许多表达改变的基因。【之前已发表文章的数据重新挖掘】通过比较受VSV感染的人MDM数据和小鼠腹膜巨噬细胞数据，发现了一些共同的基因，它们被上调了三倍以上，包括FFAR2，ZEB2，TIPAP，PTGS2，CMPK2，ZNFX1和CSRNP1。随后敲除A549细胞中的这些基因，用VSV-eGFP（VSV-增强型绿色荧光蛋白）感染细胞，流式细胞术检测GFP阳性细胞的百分比表明，敲减ZNFX1（其抗病毒作用尚未见报道）促进了VSV感染。


补充图1

研究表明，属于RNA解旋酶SF2的DExD/H-box RNA解旋酶在抗病毒免疫反应中起着多种作用。ZNFX1是RNA解旋酶SF1的代表，它包含一个ARM(Armadillo-type fold)域、一个P环解旋酶域和一个锌指（ZF）域。因为来自解旋酶SF1和SF2的基因共享一个保守的核心结构，以两个串联的RecA域为特征，所以作者认为SF1也可能在抗病毒免疫中发挥重要作用。

为验证假设，作者使用IVT-SAPAS数据分析了SF1和SF2的基因表达谱，发现这两个亚家族中的许多基因在VSV感染后表达都有变化（图1a）。流式细胞仪分析结果表明，敲低A549细胞中的MOV10、HELZ2、UPF1和ZNFX1导致VSV复制明显增强，而敲除SEXT引起相反的结果。MOV10、UPF1和SEXT以前被报道与抗病毒免疫有关，验证了基于RNAi和病毒感染的筛选方法有效，并暗示ZNFX1可能是未发现的抗病毒分子。

为了更深入地了解ZNFX1在抗病毒应答中的作用，进行了qRT-PCR或免疫印迹分析，以了解VSV感染或干扰素诱导剂聚肌胞苷酸(poly(I:C))刺激A549细胞、外周血单个核细胞（PBMC）或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞后ZNFX1的表达上调（图1b–d）。qRT-PCR也证实了静脉注射VSV后小鼠脾脏和肺中Znfx1的丰度上调（包括胸腺、淋巴结脾脏和肺）（图1e）。作者还对先前收集的芯片数据集（GDS4231/4214/1271/3210/6082/6063）进行了统计分析，发现与健康对照相比，在HIV感染患者和猿猴免疫缺陷病毒（SIV）引起的脑炎猴子中，Znfx1的RNA水平明显更高（图1f,g）。此外，在不同的细胞类型（包括巨噬细胞、树突状细胞和上皮细胞）中感染病毒后，Znfx1的转录显著增加。这些数据都表明ZNFX1可能是抗病毒分子。


图1_上

2、ZNFX1是干扰素刺激基因ISG

由于病毒感染导致ZNFX1的mRNA和蛋白质水平表达均增强，接下来通过将A549细胞与人重组IFN-α和IFN-β一起孵育来检测ZNFX1是否为ISG。qRT-PCR和免疫印迹分析的结果表明ZNFX1的表达可以被IFN-α和IFN-β诱导（图1h,i）。相比之下，JAK1抑制剂鲁索替尼(ruxolitinib)可以抑制VSV对Znfx1 mRNA的诱导，并且在Ifnar1-/-A549细胞中几乎消失（图1j,k）。

图1_下

为了确定哪些核苷酸和区域Znfx1转录中很重要，使用promoter 2.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/promoter/）、JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）和CpGplot（http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/）进行识别，其中包含TATA框、GC框和CAAT框的Znfx1的-1,064~+63之间的区域，是启动子。对转录因子结合位点的进一步分析表明，Znfx1的启动子在相对集中和重叠的区域中包含STAT1、STAT2、IRF1和IRF9结合基序。基于这些分析，构建了一个Znfx1启动子报告基因载体，包含−1,064~+63之间的区域，以及一个突变的报告基因构建体，其中缺失了STAT1、STAT2、IRF1和IRF9结合motif。接下来，STAT1，STAT2，IRF1或IRF9过表达质粒和2个报告基因载体转染293T细胞，报告基因分析表明，在STAT1、STAT2、IRF1或IRF9存在的情况下，报告基因的表达可以由Znfx1启动子诱导，而不能由缺少转录因子结合位点的启动子载体诱导（图1l）。总而言之，ZNFX1是一个ISG，其病毒感染后的上调取决于JAK1-STAT1级联反应。

3、ZNFX1对于抗RNA病毒天然免疫至关重要

为了进一步探讨ZNFX1在抗病毒免疫反应中的作用，作者沉默了A549和L929细胞中ZNFX1的内源性表达，用VSV-eGFP感染，并进行流式细胞仪分析。结果表明，Znfx1的敲低显著增强了A549和L929细胞中的VSV复制（图2a）。同时，在Znfx1沉默细胞中观察到更高的VSV滴度和增加的VSV-G蛋白（图2b,c）。一致地，在VSV感染或poly(I:C)刺激后，敲低Znfx1表达可显著降低A549细胞中IFN-α和IFN-β蛋白的产生。相反，当ZNFX1过表达时，在A549细胞中观察到了较低的VSV mRNA和VSV滴度。

为了获得ZNFX1在抗病毒反应中的更多功能证据，采CRISPR介导的基因组编辑方法敲除293T和A549细胞中的Znfx1。同样发现293T和A549细胞中敲除Znfx1增强了VSV复制（图2d）。同时，在野生型或Znfx1-/-A549细胞中ZNFX1的过表达限制了VSV复制（图2e）。进一步的RNA-seq分析比较了野生型对照和ZNFX1过表达的A549细胞之间差异表达基因，结果显示参与病毒复制和I型IFN信号转导负调控的上调基因显著富集（图2f）。有趣的是，在脑心肌炎病毒EMCV和甲型流感病毒（H1N1）感染的Znfx1敲低的A549细胞中，病毒mRNA水平升高，但在单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染后并未显著改变，表明ZNFX1具有广泛的抗RNA病毒谱 。

图2_上

为了研究ZNFX1在体内的生理作用，使用CRISPR/Cas系统生成了Znfx1-/-C57BL/6J小鼠。Znfx1-/-小鼠存活，没有明显的生理或行为异常。在这项研究中使用了六至八周大的小鼠。首先，分离野生型和Znfx1-/-小鼠的BMDM并用VSV、EMCV、H1N1或HSV-1感染，与野生型相比，Znfx1-/-BMDM的IFN-α或IFN-β分泌较低。RNA病毒感染后，包括VSV、EMCV和H1N1，但不包括HSV-1（图2g），Znfx1-/-BMDM中检测到较高的病毒mRNA水平，但在HSV-1感染的细胞中未检测到较高的病毒mRNA水平（图2h）。与野生型相比，Znfx1-/- MEF和A549细胞在RNA病毒感染VSV和EMCV后表现出较低的IFN-β分泌（图2i,j）。

图2_下

ZNFX1在宿主体内对抗病毒感染的防御中的重要性：通过尾静脉向野生型和Znfx1-/-小鼠注射了VSV。与野生型小鼠相比，Znfx1-/-小鼠的肺和肝中的VSV复制增强了（图3a），随着肺和肝中Ifnb1表达的减少，在Znfx1-/-小鼠中血清中IFN-α和IFN-β的分泌降低（图3b，c）。而HSV-1感染后，Znfx1-/-和野生型小鼠之间血清中的IFN-α和IFN-β没有差异（图3c）。有趣的是，VSV感染一天后，Znfx1-/-小鼠中有80％患有结膜炎，这是VSV感染的早期症状（图3d）。另外，观察到VSV感染后炎性细胞更多地渗透到Znfx1-/-小鼠的肺中（图3e），并且Znfx1-/-小鼠在存活试验中对VSV感染的抵抗力较弱（图3f）。这些数据表明，Znfx1缺乏后体内产生较少的I型IFN，削弱了针对RNA病毒感染的先天免疫反应。总之，ZNFX1专门针对RNA病毒发挥其抗病毒特性。


图3

4、ZNFX1启动基于IFN的抗病毒反应

为了研究ZNFX1在IFN信号传导中的作用，通过ZNFX1过表达质粒和Ifnb1-reporter或IFN刺激的应答元件（ISRE）报告质粒瞬时转染A549细胞进行萤光素酶报告基因分析，然后进行或不进行VSV感染。结果表明，ZNFX1的过表达轻微激活了Ifnb1启动子和ISRE报告基因（图4a）。此外，ZNFX1以剂量依赖的方式显著增强了由VSV、2种类型的poly(I:C)或poly(dA:dT)触发的Ifnb1启动子激活（图4b,c）。相反，敲除Znfx1可降低VSV诱导的293T细胞中Ifnb1报告基因和ISRE报告基因的激活（图4d）。Ifnb1和ISGs的转录以剂量和时间依赖性的方式诱导（图4e），当ZNFX1在A549细胞中过表达时随着剂量和时间增强反之敲除ZNFX1则降低。而与野生型细胞相比，Znfx1-/-A549和MEF细胞中ISG蛋白表达量分别减少（图4f）。VSV感染后Znfx1-/-巨噬细胞中TBK1和IRF3的磷酸化低于野生型巨噬细胞（图4g）。在VSV感染的Znfx1-/-293T细胞中，IRF3的二聚化也低于野生型细胞（图4h）。野生型A549细胞中观察到了VSV的限制性复制，但在Ifnar1-/-A549细胞中未观察到（图4i）。所有这些数据表明，ZNFX1通过诱导I型IFN的产生而参与抗病毒免疫反应，其抗病毒特性也取决于IFN信号传导。

图4

5、ZNFX1直接结合病毒RNA

属于RNA解旋酶SF2的许多基因被鉴定为结合病毒RNA的RNA病毒传感器，因此假设属于SF1的ZNFX1也可能作为RNA传感器结合病毒RNA。为证实这一假设，首先在293T细胞中过表达ZNFX1，然后进行pulldown和qRT-PCR分析以确定ZNFX1与VSV-RNA的高结合能力（图5a,b）。也检测了内源性ZNFX1与A549细胞中的VSV，EMCV和仙台病毒（SeV）RNA的结合能力（图5c）。通过用抗内源性ZNFX1的抗体从免疫沉淀物中分离RNA来进行RNA免疫沉淀（RIP）测序分析，将ZNFX1相关的RNA比对到VSV基因组（图5d），优先定位于约6,000-8,000 nt的VSV片段（图5e）。值得注意的是，当与ZNFX1相关的RNA转染到A549细胞中时，通过qRT-PCR和荧光素酶活性分析观察到了Ifnb1的诱导转录和基于Ifnb1启动子的报告基因的诱导表达（图5f）。

为了进一步评估与ZNFX1结合的病毒RNA的性质，首先将核酸类似物连接的磁珠与经Flag标记的ZNFX1、RIG-I或MAVS过表达的293T细胞裂解液一起孵育，并进行了pulldown试验以显示ZNFX1和RIG-I蛋白与poly(I:C)结合，但不与poly(C)结合（图5g）。cGAS而非ZNFX1结合单链和双链DNA（ISD，一个45 bp的双链DNA；图5h）。竞争实验显示ZNFX1蛋白与HMW poly(I:C)优先结合，而不是与LMW poly(I:C)、poly(dA:dT)或5’pppdsRNA优先结合（图5i）。为了找到ZNFX1的poly(I:C)结合位点，准备了ZNFX1的截短版本并进行了poly(I:C) pulldown实验。结果表明，ZNFX1与poly(I:C)的结合需要ARM域和P环结构域，而不是ZF锌指域（图5j）。病毒感染后ZNFX1的寡聚化增强（图5k,1）。因此，ZNFX1充当RNA病毒传感器，它倾向于结合长RNA分子。

 

图5

7、ZNFX1定位于线粒体并与MAVS相互作用

为了确定ZNFX1的亚细胞定位，将受VSV感染的细胞分为细胞质和细胞核部分，主要在细胞质中检测到ZNFX1蛋白（图6a）。以前有关含ARM域的蛋白ALEX3和ARM1的研究表明，这些蛋白是线粒体定位的。因此，通过免疫印迹分析确定ZNFX1是否也可以定位于该免疫相关细胞器上。结果显示，从VSV感染的细胞中分离出的线粒体部分中ZNFX1蛋白量增加（图6a）。共聚焦显微镜证实过表达的ZNFX1蛋白与线粒体共定位，病毒感染后观察到ZNFX1斑点扩大（图6b）。为了进一步探索ZNFX1的线粒体定位，进行了蛋白酶保护测定。如图6c所示，当用不含Triton X-100的蛋白酶K处理线粒体时，MAVS和大多数ZNFX1蛋白被消化，表明ZNFX1是线粒体外膜蛋白。相反，细胞色素c氧化酶亚基IV（COX IV）是线粒体内膜蛋白，对蛋白酶K消化有抵抗力。进一步对线粒体进行碱提取，回收具有外周膜蛋白的上清液和具有完整膜蛋白的沉淀物，发现外膜整合蛋白MAVS主要在提取后的沉淀中回收，但在2个馏分中均观察到了COX IV。ZNFX1在上清液中大量回收（图6c），表明ZNFX1作为外周膜蛋白定位于线粒体，如先前报道中的SARM1和ALEX3。

为了进一步表征ZNFX1在感测病毒RNA时如何转导抗病毒信号，检查了ZNFX1与涉及IFN产生的配体（包括TRIF、MyD88，MAVS和STING）的相互作用。免疫共沉淀实验表明，带有HA标记的ZNFX1与带有Flag标记的MAVS相关，但与TRIF、MyD88和STING无关（图6d）。免疫沉淀（Co-IP）实验进一步表明，ZNFX1和MAVS在A549细胞中形成天然复合物，并且病毒感染后ZNFX1表达上调而增强了它们的结合（图6e-g）。共聚焦显微镜实验还表明ZNFX1与MAVS共定位（图6h）。使用一系列ZNFX1截短突变体进行进一步的免疫沉淀试验表明，全长ZNFX1和含ARM的突变体，包括F3和F5，都可以与MAVS相互作用（图6i）。与共免疫沉淀试验一致，ZNFX1的全长和F3截短突变体过表达导致了Ifnb1和ISG的诱导表达以及受限制的VSV复制（图6j）。此外，如果没有跨膜（TM）域，ZNFX1不能与截短的MAVS相互作用（图6k），ZNFX1的线粒体分布与其与MAVS的相互作用无关。

 

图6

7、ZNFX1介导的信号独立于RIG-1和MDA5

为了验证ZNFX1在产生独立于现有抗病毒传感器RIG-1和MDA5的抗病毒免疫反应中的作用，首先进行了共免疫沉淀试验，发现ZNFX1在静止或受VSV感染的细胞中既不与RIG-1也不与MDA5相互作用，qRT-PCR分析结果表明Znfx1缺乏并不影响RIG-1、MDA5和MAVS介导的Ifnb1表达的诱导（图7a）。此外，过表达的ZNFX1可以强烈诱导野生型和Mda5-/-细胞中Ifnb1和Ifit1的mRNA表达，在Rig-I-/-细胞中略有诱导，但在Mavs-/-细胞中则没有效果（图7b）。当分别用ZNFX1、RIG-1和MDA5过表达质粒转染细胞时，Mda5-/-细胞中VSV和EMCV的病毒载量降低（图7c）。同样，FACS分析表明，VSV-eGFP感染的野生型、Mda5-/-和Rig-I-/-细胞中的GFP+细胞百分比降低（7d,e）。通过进行poly(I:C)处理与否的Rig-I-/-A549细胞RNA-seq，观察到ZNFX1的过表达增强了poly(I:C)刺激下Rig-I-/-A549细胞中IFN和ISG的诱导（图7f）。分别用ZNFX1或RIG-I过表达质粒转染Znfx1和Rig-I双敲除细胞（DKO）中VSV和poly(I:C)诱导的Ifnb1和Ifit1表达增强（图7g,h）。此外，ZNFX1的siRNA敲低可以进一步增强Rig-I-/-细胞中VSV-eGFP的病毒载量（图7i）。DKO细胞中VSVeGFP的病毒载量远高于Rig-I-/-细胞中的病毒载量（图7j）。所有这些结果表明ZNFX1无需依赖RLR(视黄酸诱导基因/RIG-1样受体)即可发挥其抗病毒作用。

 

图7

小结

总之，作者分析了先前发表的水疱性口炎病毒（VSV）感染的单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）体外转录-多聚腺苷酸化位点测序（IVT-SAPAS）数据，确定ZNFX1（解旋酶SF1的成员）为ISG和线粒体定位的dsRNA传感器。ZNFX1可以通过感测病毒RNA并与MAVS相互作用而在RNA病毒感染后立即启动IFN和ISG表达，而无需依赖RLR(视黄酸诱导基因/RIG-1样受体)。ZNFX1的鉴定不仅阐明了RNA解旋酶SF1在抗病毒免疫中的功能，而且为抗病毒治疗提供了目标。

图片文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31685995

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