Nanopore助力宫颈癌样本中的HPV整合位点检测

一、数据质控

作者通过对目标区域捕获后进行文库构建，分别进行Nanopore和Illumina测序，分别获得130.2 Mb和1.64 Gb的clean reads（图1）。

 图1

二、通过Nanopore和Illumina数据鉴定HPV整合位点

作者构建Nanopore分析pipeline（图2A），通过Blast与人和HPV16病毒基因组进行比对，共识别339个整合位点，通过过滤筛选最终剩余60个位点进行后续的分析。Illumina测序共获得1718个整合位点，筛选reads覆盖度大于3的位点54个进行后续分析。

 图2

所有断点在染色体上的分布见图3A。染色体chr20、chr2、chr6分别由12、11和8个断点，chr1和chrX均存在7个断点，其余染色体断点分布均在5以下。在每个位点上的reads覆盖度从2~406不等，大约有31.7%以上的位点覆盖深度在10以上。在top5的覆盖深度位点中3个位于chr20（HPV16:2804,chr20:32516985 (406 reads)；HPV16:7139,chr20:32478733(169 reads)；HPV16:4276,chr20:32502143(51reads)），2个位于chrX（HPV16:5534,chrX:20464412 (132 reads)；HPV16:3163,chrX: 20462930 (50 reads)）。

图3B展示了60个位点在HPV基因组上的分布，L2基因中有18个，L1中有12个，E1中有11个，E2中有7个，其他每个基因（E6，LCR，E5和E7）上小于4个。

在人基因组上，有38个位点在基因间区，18个位于内含子区域，2个位于非编码区域，1个位于外显子区域，1个位于downstream区域。

进一步分析人基因组上的位点分布，在chr20染色体上的12个位点中，有10个在基因CHMP4B和RALY-AS1之间，有一个位于KIF3B和ASXL1之间，最后一个位于基因ATRN的内含子区域。除了chr20染色体外，其他染色体上也有明显的位点聚集趋势，例如，chrX染色体上的6个位点在基因RPS6KA3和CNKSR2之间，chr6染色体上的3个位点位于基因CAGE1的内含子或者downstream区域。

图3

三、在不同数据集中的位点差异

在Illumina测序获得的54个整合位点中，有19个与之前报道的相符。整合所有位点并做韦恩图（图4），有13个位点是3种数据（Nanopore、Illumina、published）都存在的，这表明不同平台间重复性很好。共有18个位点同时出现在Nanopore和Illumina中，三个位点同时出现在纳米孔测序和以前发表的论文中，只有一个位点在Illumina和已发表的论文重叠。在两个平台中确定的整合位点中，一些断点具有高度丰富的reads数，例如HPV16：2804，chr20：32516985，Nanopore结果中有406个reads，Illumina结果中有1439个reads。其他断点的reads数很少，例如HPV16：4250，chr21：97550764，其中Nanopore结果中有两个reads，而Illumina结果中只有四个reads。

除了重叠的位点外，每个平台都有自己独特的整合位点。 Nanopore、Illumina和文献中，分别拥有26、22和2个唯一的整合位点。在Nanopore识别的26个位点中，其中6个reads支持度在6以上。因此，在Illumina，Nanopore和文献这三种方法确定的整合位点中，Nanopore具有相对可靠的丰度，可以确定准确的整合位点。

 图4

作者为了测试数据确定的新整合位点的准确性，利用Sanger测序进行验证。总共选择了14个整合位点进行验证，并对13个进行PCR扩增并成功测序，表明这些整合位点的真正阳性，这些阳性位点大多由Nanopore和Illumina平台鉴定。

图5

四、受影响的基因功能分析

合并3种不同平台的整合位点，并对整合完的83个位点进行注释，并进行了进一步的功能分类和途径分析。这些基因分为八个生物学过程，包括RNA聚合酶II启动子的转录正调控（6个基因），RNA聚合酶II启动子的转录负调控（6个基因），RNA聚合酶II启动子的转录调控（5个基因）， RNA聚合酶II启动子的转录（4个基因），视黄酸受体信号传导途径的负调控（2个基因），皮肤屏障的建立（2个基因），近端/远端模式形成（2个基因）和胚胎肢体形态发生（2个基因）六个胞质（13个基因），核质（8个基因），胞外外泌体（8个基因），蛋白质结合（6个基因），DNA结合（2个基因）和肌动蛋白结合（2个基因）。