【项目案例】群体研究——BSA、遗传图谱应用案例

利用基因组重测序技术进行大规模高通量SNP标记鉴定是当前国际上动植物基因组学的研究热点。利用得到的大量SNP标记，可以对群体进行高密度遗传图谱、BSA、GWAS、遗传进化等分析。百迈客在群体研究领域又有哪些应用呢？下面和小编一起学习一下遗传图谱和BSA的项目案例。

遗传图谱

遗传图谱（Genetic map），是基于全基因组重测序技术或简化基因组测序技术，对某物种家系样本进行测序，利用生物信息学方法，开发SNP分子标记，计算标记间的遗传连锁距离，绘制高密度遗传图谱。利用遗传图谱，主要可以进行QTL定位，比较基因组，辅助基因组组装等科研工作。本研究报道了利用百迈客SLAF测序技术，对菊花F1群体测序并构建高密度遗传图谱，用于菊花花型等性状的QTL定位及候选基因鉴定的研究。

菊花 (Chrysanthemum×morifolium Ramat.) 作为重要的观赏性植物，花型对于它至关重要。舌状花花冠筒基部合生程度（CTMD）和舌状花相对数量（RNRF）是影响花型的两个关键性状，但由于这两个性状构成要素相对复杂，其遗传机制还未被揭示，进而限制了菊花花型改良的定向育种。
本研究对CTMD和RNRF差异较大的菊花‘Candy’和菊花‘225’亲本以及305个F1代杂交群体进行了SLAF-seq简化基因组测序，测序深度分别为57.48X，59.69X和23.52X，通过分析鉴定得到了234,648个高质量SNPs，利用高质量的SNPs构建了一套总图距为4301.5cM、平均图距为0.76cM的菊花高密度遗传图谱，为菊花花型遗传育种研究提供了丰富的遗传标记。

图1 双亲的花型表现

图2 菊花高密度遗传图谱

基于这一图谱，结合连续两年的表型数据，对9个菊花花型性状进行了QTL分析，定位到123个相关QTLs位点；控制CTMD的QTLs有16个（图3），其中有3个为主效QTLs，LOD值分别为3.77，5.09和5.23（图4）；控制RNRF的QTLs有34个（图5），其中有4个为主效QTLs。LOD值分别为4.11，4.74，4.96和5.22（图6）。

图3 CTMD性状的QTL定位结果

图4 CTMD性状的主效QTL定位结果

图5 RNRF性状的QTL定位结果

图6 RNRF性状的主效QTL定位结果

为了进一步发掘潜在的候选基因，将菊花遗传图谱与已发表的近缘物种向日葵和生菜的基因组进行共线性分析，结果发现菊花遗传图谱上有150个SNPs标记可以比对到向日葵基因组，0.12%的SNPs标记可以比对到生菜基因组；依据基因组注释信息，检测得到向日葵基因组中有8个候选基因与CTMD和RNRF相关，生菜基因组中有20个候选基因与CTMD和RNRF相关。利用同样的方法，对甘野菊（C. seticuspe）的参考基因组和两个野生菊花，毛华菊（C. vestitum）和甘菊（C. lavandulifolium） 的转录组数据做了分析，得到了一些与CTMD和RNRF性状相关的候选基因。
本研究通过构建菊花高密度遗传图谱，为菊花高密度遗传定位和与花型性状相关的QTL鉴定提供了有用的基准信息，为进一步阐明菊花花型遗传机理提供了新见解，同时也有利于加速菊花花型的定向改良育种。

Bulked Segregant Analysis (BSA)

BSA（Bulk Segregant Analysis）分析是利用极端性状个体混池快速进行功能基因挖掘的常用方法，广泛应用在植物基因克隆方面。利用该方法，可以快速的对单一性状进行精细定位，加速目标性状的功能基因组研究进程。本研究利用百迈客SLAF-BSA-seq技术，结合亲本重测序，对番茄柱头外露基因进行基因定位，并对定位基因进行功能验证。

番茄（Solanum lycopersicum）作为自花授粉作物，有着超然的杂种优势，其杂交品种产量高，抗性好，因此番茄在生产上多采用杂交种。目前，在研究番茄杂交育种过程中，利用雄性不育系协助杂交种子的生产成为了新趋势。本研究主要从形态、生理及基因定位三个方面进行研究。
本研究利用石蜡切片法对其结构变化及不育原因进行观察，观察不育材料T431（图1E）与对照材料（图1B）成熟花柱的横切，可以看出不育材料T431花柱中的维管束数目多于对照材料。同时形态观察时发现不育材料花柱直径显著大于对照材料，维管束数目的增多可能直接导致了不育材料花柱直径变大（图1C, D, F, G）。观察成熟花柱的细胞发现不育材料与对照材料花柱细胞大小没有显著差别。因此说明不育材料花柱伸长是由花柱细胞数目增多导致而非细胞体积变大导致。

图1 花柱解剖结构图

采用高效液相色谱法对花柱中不同时期的五种激素含量的变化进行了分析，从整体含量变化来看，不育材料T431中IAA的增长率达到了176.6%，而对照材料中IAA的增长率仅为25.6%，说明不育品种中花柱维管束数目增多可能是由于IAA水平的升高导致（图2 A）；GA3含量整体变化趋势一致，GA3含量在不育材料T431中均高于对照材料（图2B）；在花发育前期可育材料中ZT含量高于不育材料T431，后期出现波动（图2C）；ABA含量在对照材料中从整体上来看呈稳步上升趋势，而不育材料T431中则较为平稳，并没有明显的变化（图2D）；不育材料T431中SA含量在花不同发育时期的变化趋势与对照材料呈现相反的趋势（图2E）。结果表明不育材料T431中GA3水平的提升，IAA和ZT含量的积累，ABA与水杨酸的不同变化趋势以及这5种激素间的相互作用均对花柱的伸长产生了影响，导致不育的发生。

图2 T431（不育材料）和DL5（对照材料）中不同激素在不同时期的变化趋势
1-4分别表不花蕾长度0.5 cm．0.7 cm，0.9 cm，1.1 cm；5-8分别表示花瓣开张角30°，45°，60°，90°。

作者利用亲本重测序技术与Super-SLAF-BSA-seq的方法相结合来对番茄部位不育基因进行定位。以番茄位置不育型雄性不育材料T431为父本，可育材料DL5为母本进行杂交，得到F1代，再将F1代自交获得F2代分离群体，在F2代中选取50株不育株和50株可育株，构建可育池和不可育池，提取父本和母本的DNA，构建父本池和母本池，最终得到4个混池；分析发现两个子代混池样本间共有154,756个SLAF标签，使用BWA软件将SLAF标签定位到番茄基因组上，对不同染色体上的SLAF标签和多态性SLAF标签的数目进行汇总（图3）,通过SNP的检测和过滤，最终得到9,411个高质量的可信SNP位点。

图3 SLAF标签分布图（A）和多态性SLAF标签分布图（B）

接着利用混池间差异SNP的深度差异，使用ED算法来分析计算与目的基因相连锁的区域，结果显示12号染色体上存在两个较大且较明显的区域，这两个区域的大小分别为1.75 Mbp和3.15 Mbp，作者最终确定这两个区域与目标基因相连锁，并将其选为候选区域（图4）；利用百迈客云平台分析，在番茄12号染色体上的两个候选区域内共找到26个候选基因，通过GO、KEGG数据库比对分析，最终将Solyc12g027610.1确定为本研究的候选基因；对该基因功能进行分析发现，Solyc12g027610.1参与了细胞分裂素的代谢过程，且与多种激素的信号转导途径有关。另外，Solyc12g027610.1作为一个乙烯受体蛋白，与番茄乙烯受体基因SlETR以及拟南芥中编码蛋白AtEIN4的乙烯基因高度同源。

图4 两个混池的BSA分析结果

最后，作者对番茄SILst基因进行基因功能验证及亚细胞定位；亚细胞定位结果显示，基因SlLst于细胞核和细胞膜中均有分布；通过对基因SlLst过表达番茄的表型分析进行基因功能验证，表明基因SlLst在柱头外露过程中起重要作用。
本研究分析了番茄外露柱头的形态变化和激素作用，结合亲本重测序和SLAF-BSA-seq，快速定位到番茄外露柱头候选基因SlLst，并对基因SlLst进行了功能分析，为基因克隆及分子标记辅助育种提供一条强有力的途径。

好消息

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参考文献

[1] Song XB, Xu YH, Gao K, et al. High-density genetic map construction and identification of loci controlling flower-type traits in Chrysanthemum (Chrysanthemum × morifoliumRamat.). Hortic Res, 2020.07

[2] Cheng MZ, Gong C, Zhang B, et al. Morphological and anatomical characteristics of exserted stigma sterility and the location and function of SlLst (Solanum lycopersicum Long styles) gene in tomato. Theor Appl Genet. 2020.11