众所周知，要获得基因组的完整图片，就必须组装reads，以目前主要的测序技术来看，短读长测序提供了很高的z确性，但仅提供了少量数据片段，从而只能得到不完整的图片；而传统的长读长测序，可提供更大的图像，但缺乏z确性，因此很难分辨出真实的生物学变异与测序错误之间的区别。然而，兼顾长读长与高精度的HiFi测序正在改变一切，今天我们就来聊聊HiFi测序以及百迈客PacBio SequelⅡ平台HiFi产出情况吧。
一、何为 HiFi测序
HiFi reads（High Fidelity reads）是2019年由PacBio推出的基于环化共有序列（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式产生的既兼顾长读长（10-20kb的长度）又具有高精度（>99%z确率）的测序结果。
在CCS测序模式下（图1），酶读长远大于插入片段长度，聚合酶会绕着模板进行滚环测序，插入片段会被多次测序。单次测序中产生的随机测序错误，通过环形测序生成的一系列Subreads来进行自我打磨，通过算法进行自我纠错校正，最终得到高z确度的HiFi reads。
图1 HiFi reads是如何生成的
二、SMRTbell文库的构建流程简述
1.SMRTbell文库的结构
bell即“铃”的意思，如图2，构建完成的bell文库形状就如同一个哑铃。其主要组成部分是：发卡状的接头（Hairpin Adapter）和双链DNA模板（Double Stranded DNA Template）。而文构建完成后、测序前还需要完成bell文库、Sequencing Primer、DNA Polymerase的混合工作（测序引物退火结合bell文库，然后引物-bell文库复合物结合DNA聚合酶）。最终产物如图3所示。
2.SMRTbell文库构建流程
以基因组HiFi文库为例（15-20K文库）（图4）。当得到gDNA后，先利用G-tube管或Megaruptor System将基因组片段化至合适大小，而后通过去除单链悬突、损伤修复和末端修复等步骤，得到完整的双链插入片段。接下来，通过将接头连接至双链DNA来创建SMRTbell文库，从而得到环状模板。完成接头连接后，需要对连接产物进行纯化，利用酶处理（图5）来消化线性或内部损伤环形DNA分子（游离的Hairpin Adapter、两端未连接Adapter的DNA模板、已成环但内部有损伤的DNA模板），酶处理完毕后，一般会利用Bulepippin或Sage ELF System切胶回收目标大小范围内的文库。
图5 酶处理示意图
三、HiFi测序的性能
1.使用HiFi Reads 进行基因组De Novo组装的能力
在基因组从头组装方面，研究者利用HiFi reads应用FALCON、Canu和wtdbg2算法分别对HG002基因组进行了从头组装，结果显示组装质量均较高，contigN50超过15Mb，并且与HG002标准结果高度一致，吻合率达到99.9983%（Q47.7）[1]。
表1 不同测序技术及分析流程组装结果
2.使用HiFi测序检测人类基因组变异的能力
基因组测序中重要的自然是z确率，只有保证较高的z确率，基因组的研究才有价值。下图展示了最近的PrecisionFDA 真实挑战赛V2的结果（图6），在单一技术参赛结果中，使用PacBio HiFi数据（粉红色）在所有类别中，无论是全基因组范围（“所有基准区域”），还是在难以映射的区域或是主要的组织相容性复合体（MHC）中均提供了较高的z确性。所有的多技术参赛结果（橙色）中都使用了PacBio HiFi数据[2]。
图6 PrecisionFDA Truth Challenge V2结果
另外，由下图可以看出（图7），Google DeepVariant使用HiFi数据提交的结果在所有单一技术检测全基因组范围内的变异z确性*高，对SNV√确度和召回率可以达到99.9%，对插入缺失的√确度和召回率可以达到99.4%[2]。
图7 不同测序技术及分析流程结果对比
四、百迈客HiFi测序数据展示
百迈客自2019年引进PacBio SequelⅡ平台以来，在HiFi测序方面已经积累了大量的经验，在技术人员的不断优化下，HiFi文库单cell产出更是有了新的突破，下面跟大家分享一下部分HiFi文库产出情况（表2）。在统计近1个月的HiFi cell中，我们单cell平均产出达416Gb。其中，单cell产出达400 Gb以上的占比达68%，同时，单cell的HiFi reads数据量高达32 Gb，占原始产出的比例*高可达7.96%。在读长方面，平均酶读长已超70Kb，HiFi reads长达18Kb。
表2 百迈客部分HiFi文库下机数据产出统计表
HiFi数据由于其长读长和高z确性，结合针对HiFi reads开发的组装软件，在基因组组装上有着较大优势。一般物种，单套30×CCS数据即可满足基因组组装需求，且无需繁琐的纠错过程，缩短组装时间，并能够识别复杂基因组区域的细微差别，有助于增加基因组组装的连续性、z确性和完整性。
在基因组组装方面，HiFi测序正受到众多科研工作者的青睐，已经成为越来越多研究者的不二之选，百迈客自2015年国内引进PacBio三代测序平台以来，在基因组研究领域已经有近百余篇合作文章发表于世界知名期刊，累计影响因子600+，目前已经拥有成熟的从测序到分析的完整HiFi流程，欢迎各位老师前来咨询！
参考文献
[1]Wenger A M , Peluso P , Rowell W J , et al. Accurate circular consensus long-read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome[J]. Nature Biotechnology, 2019, 37(11).
[2]PacBio.In precisionFDA Challenge,PacBio HiFi Reads Outperform Both Short Reads and Noisy Long Reads.https://www.pacb.com/blog/precisionfda-challenge/[EB/OL].2020.08.11
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