高分转录组研究思路|2020年百迈客医学高分案例集锦-上

今年疫情突发，不知不觉已经和疫情抗战了大半年，九月倏然而至。北京的夏天真是酷热，前不久去阴雨绵绵的昆明，竟嗅到清甜的“三秋桂子”，心中不禁惊诧：原是秋到了。

秋天本是丰收的季节，百迈客医学今秋有何收获呢？嗯，言归正传，接下来我们要讲一讲今年，2020年，百迈客医学的文章硕果。我们看一看课题如何设计，怎么利用测序技术发文章。下面整理了部分5分以上的百迈客医学合作文章研究思路简介。

 

案例一：转录组多组学解析揭示Tfr1基因对米色脂肪组织的产热能力以及分化的影响

在寒冷刺激下或者β肾上腺素能受体激动剂处理后，WAT白色脂肪组织中会出现散在的棕色样脂肪细胞，称为“棕色/米色脂肪”组织Brown/Beige adipose tissue，属于产热脂肪。铁稳态对于维持多种细胞类型的细胞功能至关重要。但是，铁是否会影响脂肪细胞的产热特性目前尚不清楚。

研究思路：本文首先从3个组学：β肾上腺素能受体激动剂CL-316,243处理的米色脂肪细胞活跃启动子标记H3K9/14Ac Chip-seq 以及生理盐水对照组同时进行RNA-seq、iTRAQ蛋白组测序，多组学整合分析鉴定调控米色脂肪细胞发育的关键候选基因Tfr1。再通过构建候选基因敲除小鼠模型，从表型、组织、基因表达（RNA-seq）、蛋白表达到机制，层层递进，逐步由浅到深解析。最终发现Tfr1通过铁依赖性和非铁依赖性机制在产热脂肪细胞中起重要作用。

 

 

案例二：成纤维细胞重编程为自组织的感觉神经节类器官和视网膜神经节细胞

文章题目:Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts

杂志&IF:Sci Adv,IF=13.116

合作单位：中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室&武汉大学人民医院眼科中心

鉴于类器官的优势，在研究发育机制以及对相关疾病进行建模和治疗方面，作者试图使用可控制体内感觉和视网膜神经节发育的转录因子TF，将小鼠和人成纤维细胞重编程为神经节类器官和视网膜神经节细胞RGC。SG体感神经节和RGC之间广泛的分子同源性，区分这2种类型的神经元是一个难题，需要筛选RGC特异性标记，需要筛选诱导成纤维细胞自组织和网络化的iSG(induced SG)和iRGC(induced RGCs)的最有效方法。

研究思路：通过对多个SG和RGC 转录因子TF的筛选，作者确定了三个TF组合ABI是重编程小鼠和人类成纤维细胞为自组织和网络化iSG类器官的最有效组合。通过免疫染色、qRT-PCR、全细胞膜片钳记录、钙成像以及混合bulk转录组和单细胞转录组scRNA-seq方法，能够证明iSG类器官具有分子和细胞特征、亚型多样性、电生理特性和周围神经支配能力和周围SG的特征模式。此外，使用免疫标记和scRNA-seq分析，鉴定出了真正的RGC特异性分子标记，以证明ABI组合具有从成纤维细胞诱导少量iRGC的额外能力。不同于iSG神经元，iRGC保持类似于视网膜中内源性RGC的分散分布模式。

 

 

案例三：间充质干细胞和各种眼细胞之间通过线粒体的细胞间转运实现生物能crosstalk

文章题目:Bioenergetic Crosstalk between Mesenchymal Stem Cells and various Ocular Cells through the intercellular trafficking of Mitochondria

杂志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作单位：温州医学院附属眼视光医院视网膜再生医疗研究组&首都医科大学附属北京同仁医院北京市眼科研究所

线粒体疾病会优先影响人眼中能量需求较高的组织，例如视网膜和角膜内皮。基于间充质干细胞（MSC）的治疗已被证明对眼部变性有益。但是，除了神经保护性旁分泌作用外，MSC对视网膜和角膜组织有益作用的潜在机制在很大程度上尚不清楚。这项研究中试图探究从MSC到眼细胞间转移的线粒体的命运和相关特征。

研究思路：将MSC与角膜内皮细胞（CEC）、661W细胞（感光细胞系）和ARPE-19细胞（视网膜色素上皮细胞系）共培养。免疫荧光实验、荧光激活细胞分选和共聚焦显微镜成像探究细胞间转移的线粒体的特性和命运。测量受体细胞的耗氧率以研究细胞间线粒体转移的影响。进行转录组分析以研究具有转移线粒体的受体细胞中代谢基因的表达。结果：线粒体转运/“捐赠”是MSC与各种眼细胞（包括角膜内皮，视网膜色素上皮和感光细胞）之间普遍存在的细胞间机制。此外，转运过程取决于基于F-肌动蛋白隧道纳米管。接受MSC线粒体的鱼藤酮预处理细胞显示出增加的有氧能力和线粒体基因的上调。活体成像技术确定了转移的线粒体的最终命运：通过溶酶体降解或通过胞吐作用形成细胞外囊泡。结论：首次确定了线粒体通过基于F-肌动蛋白隧道纳米管从MSCs向各种眼细胞进行细胞间转移的特征和命运，有助于表征基于MSC的眼组织再生治疗方法。

案例四：长期培养过程中维生素C通过抑制Notch3延缓牙周膜干细胞衰老

牙周膜干细胞（PDLSCs）作为牙周组织修复和再生的潜在“种子细胞”，需要在体外进行大规模扩增。长期培养过程中发生的PDLSC衰老可能会损害PDLSC的治疗效果。培养基补充剂可用于抗衰老。然而，长期培养过程中维生素C（Vc）处理对PDLSCs的作用和机制仍不清楚。

研究思路：在长期培养过程中，经Vc处理的PDLSCs细胞保持细长的形态，较高的生长速率和迁移能力，干性和成骨分化能力。此外，低传代次数EP vs 高传代次数LP vs LP+Vc处理转录组测序发现，Notch3在细胞衰老过程中显著上调，Vc处理通过抑制长期培养过程中的Notch3延缓了PDLSCs的衰老。总之，Vc处理通过减少Notch3的表达来抑制PDLSCs的衰老，这可能是一种在细胞长期培养过程中抑制细胞衰老的简单而有用的策略。

 

 

案例五:慢性酒精摄入和HBV通过HBx-SWELL1- 花生四烯酸信号传导诱导脂质代谢异常并激活HBV-Tg小鼠Treg细胞

文章题目:Chronic ethanol consumption and HBV induce abnormal lipid metabolism through HBx/SWELL1/arachidonic acid signaling and activate Tregs in HBV-Tg mice

杂志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作单位：南开大学生命科学学院分子生物学研究所肿瘤研究室

慢性酒精摄入已成为世界范围内的公共卫生问题，它在感染了乙肝病毒（HBV）的患者中促进了慢性肝病的发展。花生四烯酸代谢物前列腺素E2（PGE2）可激活调节性T细胞（Tregs）的功能。本研究旨在发现慢性乙醇酒精摄入导致HBV诱导的异常脂质代谢增强和Tregs激活的潜在机制。

研究思路：通过ELISA实验测定体内和体外花生四烯酸代谢物PGE2和LTD4含量。通过TCGA公共数据分析筛选到与肝癌预后和诊断相关的SWELL1基因。使用siRNA减弱HepG2、HepG2.2.15肝癌细胞系和K180食管癌细胞系中SWELL1的表达，然后对HepG2细胞进行转录组测序。Western blot分析和RT-qPCR用于检查临床HCC样本和细胞系中的HBx（乙型肝炎病毒X基因）、SWELL1和转录因子Sp1表达。通过流式细胞术在HBV-Tg小鼠（HBV全基因组转基因小鼠模型）中测试了慢性酒精摄入对Tregs的影响，收集酒精摄入组和对照组脾脏Tregs细胞进行转录组测序分析。结果：体内和体外观察到乙醇/酒精和乙肝病毒在脂质代谢异常中的协同作用，SWELL1（或HBx）的降低导致脂质含量和花生四烯酸代谢产物减少，乙醇和SWELL1可升高小鼠和细胞系肝脏中PGE2或LTD4的水平。乙醇通过激活HBx/Sp1/SWELL1/花生四烯酸信号传导调节了脂质代谢异常。慢性酒精摄入显著增加了HBV-Tg小鼠的PBL(外周血淋巴细胞) Tregs和脾脏Tregs的数量，这与体内和体外PD-L1表达的增加一致。RNA-seq数据显示，在以乙醇摄入小鼠或HBV-Tg小鼠的Tregs细胞中多个基因转录水平发生了改变。结论：长期摄入乙醇可通过HBx/SWELL1/花生四烯酸信号增强HBV诱导的异常脂质代谢，并激活小鼠的Tregs功能。