【项目案例】黄瓜果把长度遗传变异机制研究 | 群体研究

01 黄瓜果把长度的遗传特征

授粉30天后，双亲Jin5-508和YN黄瓜果把长度不再增长，于是选择该时间节点作为果把长度鉴定的时期（图1a）。Jin5-508果把长度显著长于YN，这种差异是因为Jin5-508果把果肉细胞体积大于YN，而非细胞数增多（图1b,c,d,e）。统计F₁群体、回交群体和F₂群体果把长度发现，F₁群体表现出中亲表型，而回交群体表型更偏向于轮回亲本，F₂群体表现出连续的近正态分布（图1f），以上结果表明黄瓜果把长度是数量性状。

图1 黄瓜果把长度遗传特征

02果把长度QTL的初定位—BSA方法+遗传图谱

作者在1231个F₂群体（Jin5-508 × YN）选择了长把和短把单株各50个，构建2个极端性状DNA混池，对该混池及双亲进行高通量测序及BSA分析。亲本测序深度分别为34x（Jin5-508）和20x（YN），混池测序深度分别为61x和52x。测序数据与黄瓜参考基因组9930比对，2个混池分别开发了342,496和399,764个SNP，基于SNP index算法，在chr7上定位到一个主效QTLFnl7.1 (阈值0.833)，区间范围9.98–14.61 Mb（图2c）。

图2 BSA定位结果

为验证BSA的定位结果，作者在3个不同环境下调查了102个F_2:3家系（Jin5-508 × YN）的表型，结果显示F_2:3表型也符合正态分布（图3a）。基于双亲重测序数据，作者在7号染色体上开发了72个双亲多态标记（SNP和InDel），用这些标记合F₂群体构建7号染色体的连锁图谱。结合F_2:3群体3个环境的表型以及F₂遗传图谱，共同定位到了1个主效QTL（图3b），表型贡献率在27.9%-32.7%。综合BSA定位和遗传图谱定位结果，最终吧QTL Fnl7.1定位在7号染色体上2.85Mb的区间内。

图3 F2:3群体表型变异及遗传图谱定位结果

03 Fnl7.1的精细定位

作者利用初定位侧翼标记InDel01和SNP01对大规模F₂单株（4000株）进行分型，筛选得到51个区间重组单株。在InDel01和SNP01区间内又开发了另外4个标记，对51个重组单株进行分型，共得到10种不同的单体型，基于个体表型及单体型数据，Fnl7.1被缩小到25.4kb的区间（标记InDel05和SNP01）（图4c）。为了进一步缩小区间范围（老师态度很严谨，佩服），作者又构建了一个更大规模的F₂分离群体（7600个单株），利用InDel05和SNP01进行分型后又得到4个F₂重组单株。F2重组单株自交得到4个F_2:3群体，在InDel05–SNP01区间内又开发了4个多态SNP标记，用这些标记对F_2:3群体进行筛选，发现有2个F_2:3群体在标记区间内发生了重组。利用重组单株的表型及单倍型分型结果，将Fnl7.1定位在14.1kb的区间（图4d），而在该区间内共有2个基因，分别为CsGy7G014720和CsGy7G014730（图4e）。

图4 Fnl7.1精细定位过程

04 Fnl7.1功能验证

克隆双亲14.1kb定位区间，测序后进行序列比对发现共有17个SNP和InDel差异，部分变异位于基因间区、内含子区，而位于外显子区的则为非同义突变，另外在CsGy7G014720启动子区有多个变异。同时，作者发现InDel05（位于CsGy7G014720启动子区）与Fnl7.1共分离。以上结果表明，CsGy7G014720（后续称作CsFnl7.1）是最有可能的候选基因。

图5 CsFnl7.1表达分析

05 CsFnl7.1启动子多态性影响其表达

序列分析显示，双亲CsFnl7.1启动子区存在多处序列差异（25个SNPs和7个InDels），因此作者将双亲的启动子进行了克隆，分别与GUS基因构建整合质粒，转化烟草叶片进行启动子活性分析。发现Jin5-508启动子（pCsLEA^J）活性是YN启动子（pCsLEA^Y）活性的4倍（图6）。这与转录组分析结果一致（授粉当天CsFnl7.1在Jin5-508表达量显著高于YN），从而说明CsFnl7.1表达受顺式调控。

图6 双亲CsFnl7.1启动子活性比较

06  CsFnl7.1转基因植株表现

为进一步验证基因功能，作者将CsFnl7.1转入短把品种“D8”中，得到3个T2代单株（OE4、OE7和OE8）。Southern杂交显示OE4、OE7和OE8分别插入1、1和2个拷贝（图7a）。与对照相比，3个转基因个体CsFnl7.1表达量显著提高，同时果把长度也更长，说明CsFnl7.1确实能够影响果把长度（图7b,c,d）。分析果把果肉细胞的个数和大小发现，转基因个体比对照个体细胞更大，但细胞数在两者之间没有显著差异（图7e,f,g），从而说明CsFnl7.1是通过调控细胞伸展来影响果把长度。

图7 CsFnl7.1转基因个体表现

07  CsFnl7.1与细胞伸展相关蛋白存在互做

利用酵母双杂技术，以CsFnl7.1蛋白为诱饵筛选与其互做的蛋白，结果显示共得到53个阳性克隆，在这些蛋白中有多个与细胞伸展相关，包括CsDRP6和CsGLP1（图8a）。体外pull down实验显示，融合蛋白HIS-CsDRP6和HIS-CsGLP1可以被GST-CsFnl7.1高效捕获，而对照GST则不能（图8b）。以上结果充分说明CsFnl7.1与CsDRP6、CsGLP1之间存在互做关系。

图8 酵母双杂及pull down分析

08  Fnl7.1的地理分布及进化分析

利用Fnl7.1启动区的变异信息，对158个品种进行进化分析，结果显示所有品种可被分为4个group，其中group1和group2主要包含来自于欧亚大陆的端果把品种，而group3主要为来自于东亚的短果把品种，来自印度多个品种在3个不同group都有分布，以上结果也可以证实Fnl7.1起源于印度的假说。

总结

本文是一篇典型的基因克隆+验证的优秀文章，从事农作物、蔬菜功能基因研究的老师可以引用参考。该研究亮点是使用大规模F2分离群体，通过BSA分析+重组个体分析，就实现了基因的精细定位，从而避免了构建高代回交群体的繁琐过程，极大地缩短了基因克隆的周期，减少了多年杂交、标记筛选等工作流程。当然，能够采用这种策略，也与物种繁殖周期、产籽量、QTL贡献率等多个因素相关（我们会在下期着重讨论这些问题），本研究的物种和性状特征符合上述要求，所以能够快速拿到基因。在这篇文章之前，2018年陈学好老师在The Plant Journal（IF=6.14）上发表了一篇黄瓜耐水淹基因克隆验证的文章“The major-effect quantitative trait locus CsARN6.1 encodes an AAA ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance by promoting adventitious root formation”，文章思路和方法与本文基本相似，也是采用大规模F2分离群体+BSA分析的方式，感兴趣的老师可以参考学习。我们不难看出，只要方法选的对，再加上细致的研究工作，就可以持续发表高分文章！

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