分类： 医学研究
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研究背景

色素性视网膜炎（RP)是常见的遗传性视网膜失明之一，大约2500个新生儿中有1个患有视网膜失明，在世界范围内超过100万人受到影响。到目前为止，RP还没有有效的治疗方法，仍然是一种具有医学挑战性的疾病。大约15%的RP是由pre-mRNA加工因子（PRPF）PRPF8、PRPF31、PRPF3、PRPF4、PRPF6和SNRNP200的突变引起的常染色体显性形式。

pre-mRNA的可变剪接通过包含不同的外显子或在mRNA中保留内含子，扩大了真核基因组的编码能力，使相对较少的基因能够编码不同的蛋白质组。高水平的剪接多样性发生在脊椎动物神经系统。例如，鼠视杆和视椎光感受器有一个特定的剪接程序，这种特殊的剪接程序主要影响编码光感受器初级纤毛和外段组成成分（光转导必需成分）的转录本。而视网膜色素上皮（RPE）的成熟也需要功能性原发性纤毛。总的来说，这些数据表明，对光感受器特异性转录本的剪接程序的√确调控对视网膜发育至关重要，包括那些参与纤毛发生的转录本。

PRPF的突变影响剪接体组装的化学计量学和动力学，导致视网膜功能所需基因的转录失调或PRPF突变蛋白的错误折叠和聚集，从而触发光感受器中的凋亡。然而，与PRPF相关的RP疾病机制尚不清楚，也不确定RPE或光感受器是否是主要受影响的组织。矛盾的是，虽然PRPF广泛表达，但是其突变只会导致视网膜特异性退化，这就提出了一个问题，为什么视网膜细胞更容易受到这些剪接因子缺陷的影响。此外，PRPF动物模型作为研究对象时，要么不能再现人类RP表型，要么仅表现出晚发性RPE缺陷。

研究结果

由于人来源的多能干细胞（iPSC）可以分化为RPE和光感受器，作者开发了患者来源的视网膜细胞作为独特的生理相关疾病模型，以期对剪接因子RP的分子发病机制有新的认识。作者从4名RP11患者iPSC中获得了RPE和3D视网膜类器官，这些患者的临床严重程度因两种PRPF31缺失突变而不同。大规模转录组分析鉴定了受PRPF31突变影响的细胞类型和患者特异性靶基因的异常剪接，提供了剪接因子RP临床表型的分子特征。以来源于一名患有非常严重RP的RP11患者的细胞为材料，作者利用CRISPR/Cas9纠正了其中的PRPF31突变，挽救了分子和细胞表型，为原位基因纠正的有效性提供了概念上的证据。

转录组测序分析可变剪接

 

致病通路示意图

事实上，不仅二代测序可以研究可变剪接，作为具有无需打断、测序读长长、定性分析等诸多优势的三代Nanopore，进行全长转录组测序更是研究可变剪接的利器。2015年，研究人员以果蝇的Dscam1基因为例，对其存在的19008种可变剪切形式，利用MinION测序仪检测到超过7000种可变剪切形式，而这样的结果则是利用NGS的测序技术不能获得的。2017年，研究人员对单个的鼠B细胞进行测序，并经Mandalorion分析，鉴定到数千个未注释的转录起始位点和终止位点，以及数百个可变剪切事件。该研究结果表明，通过Nanopore测序不仅可以识别复杂的isoforms，而且还能定量其表达水平（点击查看详细介绍）。

ONT在医学研究中的应用，除了可变剪接之外，还有转录本变异检测、结构变异检测、重复序列变异检测、HLA分型、甲基化修饰研究、微生物水平应用等，详情可在我们之前盘点的“Nanopore三代测序在医学研究中的应用”中查看哦~

北京百迈客生物科技有限公司与牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，简称ONT）达成长期合作。截至目前，百迈客已经拥有Oxford Nanopore的MinION、GridION X5和PromethION全套Nanopore测序仪。

 

参考文献

Adriana Buskin et al.Disrupted alternative splicing for genes implicated in splicing and ciliogenesis causes PRPF31 retinitis pigmentosa. Nat Commun，2018 Oct 12;9(1):4234.

 

 

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