分类： 基因组测序
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自1977年Sanger发明了双脱氧链终止法测序技术以来，新的测序技术、测序平台不断涌现。目前，三代测序技术已凭借其技术优势受到越来越多科研工作者的青睐。三代测序技术集长读长和高通量于一身，对高纯度、长读长核酸分子进行实时测序，此技术已广泛应用于科学研究及精准医疗中。三代测序的代表为Oxford Nanopore Technologies（ONT）和PicBio（PB）这两大测序平台，下面就这两个平台与大家说道说道：

测序原理

ONT测序将人工合成的一种多聚合物的膜浸在离子溶液中，多聚合物膜上布满了经改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白（纳米孔），也就是Reader蛋白，在膜两侧施加不同的电压产生电压差，DNA链在马达蛋白的牵引下，解螺旋通过纳米孔蛋白，不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号，通过对这些信号的检测，得到碱基序列，完成测序。

PB的测序空间为ZMW（zero-mode wave guides，零模波导孔），外径100多纳米，DNA分子掉入孔中，不同荧光标记的脱氧核苷酸在聚合酶的作用下，会产生不同的荧光信号，随后标记基团自动脱落，维持了信号的持续监测。激光从ZMW底部打入，由于孔直径很小而不能穿过孔进入上方溶液区，从而把背景噪音降到最低。

由此，ONT的纳米孔是指膜上的纳米孔通道蛋白，PB的纳米孔为ZMW孔，在“方寸之地”完成测序。

PB测序

ONT测序
测序仪器

ONT平台：MinION、GridION X5、PromethION；具体区别如下：

PB平台：RSII和Sequel系列仪器，目前Sequel系列平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短的特点已将RSII平台取代。

2平台发展前景！

ONT平台在软、硬件及建库技术等各方面不断升级优化，如推出的R10测序芯片，将单碱基电流信号判读率提升到2次，数据质量方面将会有了明显改善，由于小编未有足够的实测数据，目前就不做分享了。

目前PacBio推出Sequel II测序平台，其单张芯片测序通量较Sequel平台提升了8倍左右。

建库方式

ONT平台：在DNA测序方面，利用片段筛选，非片段筛选和片段打断3种方式对DNA样品进行1D建库。

片筛即利用Bluepippin对DNA样品进行片段筛选，并依据科研人员的实际研究需求梯度富集回收大片段用于建库测序。非片段筛选即DNA提取后，未经过片段筛选的过程，直接进行建库测序。片段打断即利用g-TUBE将DNA片段打断成20kb或其它大小的片段，这种技术在一定程度上可提升单cell产量，其可应用于个体重测序、甲基化等研究。倘若您想组装基因组，小编还是建议使用片段筛选的方式，富集大片段进行建库测序，经过片段筛选后，会有更大比例的长片段DNA分子穿过纳米孔，这样得到的测序读长数据相较于其它建库方式会普遍变长。

PB平台：在DNA测序方面，PB一般使用g-TUBE将DNA片段打断成20kb或30kb的文库，对打断的DNA样品进行末端修复，连接哑铃型的接头，使用Bluepippin进行片段筛选，获得测序文库。

以ONT的片筛文库和PB的文库比较，由于PB经过了片段打断，且受DNA聚合酶活性的影响，在读长方面稍逊色于ONT平台。以下就对它俩的测序数据做一比较。

测序数据

数据读长比较，后3列依次是Read_N50，平均长度和最长reads大小，单位都是bp哦。。。。

以某物种为例，我们看看各片段的分布：

总结：从这份数据可以看出，PB 平台18K以上的数据占39.6%，Nanopore平台20K以上的数据可达68%。

数据纠错

ONT平台和PB平台下机数据的准确率一般85%左右，后期Canu软件进行Reads纠错，应用Reads间去比对最长的Reads(一般后期应用30-50×的数据用于基因组组装)，数据的准确率有了大幅度提升。ONT平台应用smart、Canu、wtbdg等 3款软件进行组装，racon两轮纠错（三代数据），pilon三轮纠错（2代数据）后，可将基因组的准确率提升至99.99%。PB平台一般应用smart、Canu、wtbdg、Falcon 4款软件进行组装，arrow纠错（三代数据），pilon三轮纠错（2代数据）后，可将基因组的准确率提升至99.999%。

总述

PB、ONT各有千秋，各具特色。目前百迈客已完成三代测序平台的完整搭建，并集提取、建库、测序于一体，可满足科研工作者的不同测序需求；

 

 

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