定量蛋白质组学研究方法介绍

2018年可谓是蛋白质组学发展历程上非常重要的一年,以北京蛋白质组研究中心秦钧教授课题组关于胃癌在蛋白质层面进行分子分型研究为代表,这篇文章主要就是利用定量蛋白质组学(label-free)方法对疾病进行分型分析,最终将弥漫性胃癌在蛋白水平分成了3种不同类型,这3种不同的分子亚型对预后和化疗方案的敏感性是有差别的。

Fig.1 弥漫性胃癌肿瘤组织蛋白质组分型

我们看到,尽管都是胃癌,不同亚型的胃癌其实在蛋白的层面是不同的疾病,因此就会有不同的预后,除了癌症等领域的分子分型和标志物筛选验证以外,定量蛋白质组学在植物的生长发育、逆境胁迫、动物发育、感染性疾病等研究中也有广泛的应用。

定量蛋白质组学(Quantitative Proteomics)是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白,结合生物信息学揭示细胞生理病理等功能,同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析。

目前定量蛋白质组学应用比较广泛的方法有非标定量(Label-free)和标记定量(iTRAQ)两种。在这里我们给大家介绍一下这两种定量蛋白质组学方法:

1、iTRAQ技术

iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,而后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。

技术原理:iTRAQ标记试剂由三部分组成,报告基团、质量平衡基团和肽反应部分,(1)报告基团:有八种,相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121,因此iTRAQ最多可同时标记8组样品;(2)平衡部分:相对分子质量分别为32、31、30、29、28、27、26和24,形成相对分子质量均为145的等量异位标签,保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同;(3)肽反应部分:能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记上肽段,几乎可以标记所有蛋白质。 

 Fig.2 iTRAQ试剂结构
 Fig.3 iTRAQ实验二级质谱图

在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在串联质谱中,报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,带不同同位素标签的同一多肽产生质量为114,115,116和117Da(八标为113、114、115、116、117、118、119和121 Da)的报告离子(Fig.3中红色标记),根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

iTRAQ实验流程:

  Fig.4 iTRAQ实验流程示意图

由于iTRAQ技术上的限制,最多同时标记8个样品,所以,当样品数超过8个的时候就需要设置内参,以矫正不同批次之间的批次差异(搭桥技术)。比如:做14个样品(来源于同一组织),则需要做成两组8标的进行上机,每组7个样品加1个内参(内参是多个样品的混样),总共需要做的样品数就是7+7+1+1=16个。

TMT也是近年来应用比较广泛的差异蛋白质组学技术,与iTRAQ一样,TMT也是采用体外同位素标记的方法,利用同位素试剂标记蛋白质酶解后产生的多肽,对两个或多个样本在全蛋白质组层面上展开相对定量分析。二者区别只是不同厂家生产的标记试剂盒(iTRAQ是AB SCIEX研发,最多有8种标记试剂,TMT是Thermo Fisher研发,最多有10种标记试剂),在标签分子结构上有些许差异,其他原理基本一样。

iTRAQ技术特点:

(1)不同样本标记之后混样,统一处理上机,减少了分别上机造成的实验误差,并利用同位素标签的丰度来检测,定量更准确,重复性更好;

(2)由于需要标记试剂标记,因此成本相对较高;

(3)通量高,在一次实验中最多可同时比较8个样品;

(4)利用基于同一个参考样品的办法,可以进行多于8个样品的定量比较;

(5)iTRAQ的覆盖度高、灵敏度高。

2、Label-free技术

Label-free定量,即非标记的定量蛋白质组学,不需要对比较样本做特定标记处理,只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化,通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。

Fig.5 Label-free实验原理

Label-free实验流程: 

Label-free技术特点:(1)不需要标记处理,操作简单,成本低、实验周期短;

(2)每个样品单独处理、上机;

(3)可以做任意样本的总蛋白质差异定量,样品类型不受限制;

(4)对单个样品的蛋白总量要求相对较低,对于组织本身蛋白量不高,可以选择label-free,适用于一些难收集样品;

(5)定性没有问题,但是定量的准确性较标记定量稍差,会受到质谱稳定性等因素的影响;

(6)适合于大样本量的定量比较(大于24个样本);

 好啦,今天对于定量蛋白质组学技术的介绍就到这里了,要做标记定量还是非标记定量,大家知道了嘛~~哈哈,其实选择哪种方法是由具体的科研项目和前期的研究累计决定的,没办法说哪种技术方法更好,所以各位老师们不必纠结,只要能回答老师们感兴趣的问题就是好方法!!对蛋白质组学感兴趣的老师赶紧行动吧,扫描下方二维码联系我们~

 

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