小鼠肠道微生物多样性成功案例–蜂胶能预防结肠炎吗？

膳食中加入富含多酚的蜂胶可以预防结肠炎，那么中国蜂胶（CP）和巴西蜂胶（BP）对肠道的影响效果是否一样呐？肠道菌群多样性给你答案！

研究背景

炎症性肠病（IBD）主要包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）两种类型，是一种慢性的胃肠道疾病。尽管IBD的病因还不清楚，然而环境因素和遗传因素都会导致肠上皮屏障的功能障碍，并且与肠道菌群失调和粘膜炎症也有关。肠道微生物与结肠炎的关系非常密切。研究发现，UC患者肠粘膜中的拟杆菌（Bacteroides spp）丰度较高，通过饮食调节提高肠道菌群的多样性和粘膜的免疫系统，已为IBD的预防和治疗带来可能。

多酚是植物的次级代谢产物，具有典型的芳香或酚环结构，能够调节细胞信号转导，具有抗氧化和抗炎作用。研究发现，绿茶、浆果和咖啡等食物中都含有多酚。蜂胶是蜜蜂从多酚植物中采集的树脂物质，含有黄酮和酚酸等300多种多酚化合物，目前已经被传统医药行业广泛应用。巴西和中国是生蜂胶的两大出口国，中国的生蜂胶主要来自杨树（Populus sp），巴西的生蜂胶主要来自酒神菊树（Baccharis dracunculifolia DC），研究表明，国产蜂胶对右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的大鼠急性结肠炎具有一定的保护作用，巴西蜂胶也能使IBD患者受益。然而，不同地理位置和植物种类的蜂胶多酚组成不同，中国蜂胶和巴西蜂胶的多酚成分可能也具有差异。尽管它们在脂多糖引起的急性肝损伤、炎症因子表达的抑制、肿瘤坏死受体相关因子（TRAF-6）依赖标准NF-κB通路抑制方面具有生物等效性，然而在IBD相关的肠胃生理过程中的生物等效性仍不清楚。

本文旨在研究不同多酚组成的中国蜂胶（CP）和巴西蜂胶（BP）对右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的大鼠结肠炎是否起到保护作用。

材料与方法

1、采用HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析蜂胶中27种多酚化合物。

2、大鼠分组（共4组，每组8只）：

①正常组（Control）：饲喂常规饲料；②对照组（DSS）：饲喂常规饲料；③处理组1（CP）：饲料中添加中国蜂胶（蜂胶溶解在0.5%黄芪胶）；④处理组2（BP）：饲料中添加中国蜂胶（蜂胶溶解在0.5%黄芪胶），除了正常组，其余3组的饮用水添加了DDS（3%）。

3、疾病活动指数（DAI）根据体重变化、粪便硬度、直肠出血和整体状况（包括活力、毛皮状况、姿势和行为）进行综合评分。

4、组织病理学分析：选择末端结肠组织，H&E染色，TUNEL法检验细胞凋亡。

5、实时荧光定量PCR（RT-PCR）：末端结肠粘膜组织的白细胞介素（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白（MCP）、白细胞介素（IL-6）和转化生长因子（TGF-β）基因表达。

6、结肠炎氧化应激：结肠粘膜组织的过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化活性（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量检测。

7、微生物多样性高通量测序：盲肠内容物（150 mg/样），16S rDNA V3-V4，Illumina PE250，RDP数据库，生物信息分析：百迈客微生物多样性云平台（BMK Cloud online）。

结果与讨论

1、蜂胶中的多酚特征

从图1a来看，CP比BP的多酚化合物种类更丰度，CP的咖啡酸苯酯（29.48 mg/g）含量较高，BP的阿特匹林C（25.6 mg/g）含量较高。

图1. a：HPLC-DAD/Q-TOF-MS检测27种多酚在CP和BP中的浓度；b：DSS、CP和BP组大鼠的疾病活动指数（ADI）；c：对照组、DSS、CP和BP组大鼠的直肠长度。

2、蜂浆缓解了DSS诱导的急性结肠炎

葡聚糖硫酸钠（DSS）导致了大鼠的疾病活动指数（DAI）升高，体重减轻，结肠长度明显变短。与DDS（对照组）相比，CP和BP组均显著提升了大鼠的DAI值（p＜0.05，ANOVA）（图1b），减缓了DSS诱导的肠炎症状，缓解了体重减轻，显著抑制了结肠短缩（p＜0.05）（图1c）。

3、蜂浆缓解了结肠损伤

DSS组的大鼠末端结肠组织产生了明显的损伤，隐窝产生缺损，白细胞发生渗透；CP和BP组的大鼠结肠组织的坏死和溃疡较少（图2A; 2B）。DSS组的大鼠结肠上皮TUNEL阳性细胞增多，然而DP和BP组中的凋亡细胞数明显较少（图2C; 2D）。

图2. CP和BP对大鼠结肠组织的损伤修复。A：末端结肠HE染色；B：组织病理半定量分值（结肠损伤、白细胞渗透）；C：结肠细胞凋亡的组织学切片镜检；D：TUNEL法检验结肠细胞凋亡（个数/面积）。

4、蜂浆影响了结肠炎相关基因的表达

与DSS组相比，CP和BP组的大鼠结肠炎症因子IL-1β、MCP-1和IL-6基因表达显著降低（p＜0.05），BP组的TGF-β基因表达显著升高（p＜0.05）（图3A-D）。

图3. CP和BP对大鼠结肠炎症相关基因表达的影响。A：白细胞介素（IL-1β）；B：单核细胞趋化蛋白（MCP-1）；C：白细胞介素（IL-6）；D：转化生长因子（TGF-β）。

5、蜂浆对结肠炎氧化应激的影响

与DSS组相比，CP和BP组的大鼠结肠炎症氧化应激指标MDA含量显著降低（p＜0.05），CP组的T-AOC含量显著升高（p＜0.05）、SOD含量显著降低（p＜0.05），BP组的CAT含量显著升高（p＜0.05）（图4A-D）。

图4. CP和BP对大鼠结肠炎症氧化应激的影响。A：过氧化氢酶（CAT）；B：超氧化物歧化酶（SOD）；C：总抗氧化活性（T-AOC）；D：丙二醛（MDA）含量。

6、蜂浆对盲肠微生物多样性的影响

CP组的肠道中含有719种独特OTU（图5A），与BP组和DSS组的菌群结构存在明显的差异（图5B）。与其他3组相比，CP组的拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）显著较低，α-变形杆菌（alphaproteobacteria）、酸杆菌（Acidobacteria）、Solibacteres、芽单胞菌（gemmatimonadetes）、酸微菌（Acidimicrobiia）和鞘脂杆菌（Sphingobacteriia）仅存在于CP组中（图5C; 5D）。单胞菌（Gemmatimonadaceae）、Gemmatimonadales、红螺菌（Rhodospirillales）和黄单胞菌（Xanthomonadales）在CP组中显著较高，拟杆菌属（Bacteroides）和Bacteroidaceae在BP组中显著较高（图6A; 6B）。相关性分析表明，Bacteroides（r=0.86，p=0.001）、Ruminiclostridium（r=0.43，p=0.035）和Ruminiclostridium 9（r=0.576，p=0.003）与组织学指数显著正相关（图2B）。CP和BP组的Bacteroides.spp相对丰度显著高于DSS组（p＜0.05）。

图5. CP和BP对大鼠结肠炎症肠道微生物的影响。A：韦恩图；B：PCoA分析（基于weighted UniFrac的组间样品差异分析）；C：丰度聚类热图；D：丰度柱状图（“门”水平的前15个物种）。

图6. 大鼠肠道微生物的LEfSe分析。A：物种分类进化分支图（LDA＞4）；B：关键物种的相对丰度热图；C：Bacteroides spp的相对丰度。

结论

尽管中国蜂胶（CP）和巴西蜂胶（BP）的多酚组成不同，产生的生理效应也不同，然而它们均显著降低了拟杆菌（Bacteroides spp）的种群丰度，从而对DSS诱导的结肠炎起到了的相似的保护作用。

参考文献：

Wang K, Jin X, Li Q, et al. Propolis from Different Geographic Origins Suppress Intestinal Inflammation in a Model of DSS-Induced Colitis is Associated with Decreased Bacteroides spp. in the Gut.[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2018, 62(17):1800080-.

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