外泌体小RNA测序揭示成肌细胞外泌体促进成骨分化【成功案例】

C2C12成肌细胞外泌体通过miR-27a-3p促进前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化

研究背景

越来越多的证据表明，骨与肌肉组织可以影响葡萄糖、能量等代谢。最近，已有报道骨骼和肌肉也可以通过内分泌方式相互调节。并且已确定了一系列参与相互调节的肌肉或骨骼调节剂。关于影响骨形成的候选肌因子（myokines ），胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、骨甘氨酸、FAM5家族、白细胞介素-7（IL-7）、IL-5、鸢尾素、卵泡抑素、骨粘连蛋白和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）作为成骨促进剂，而肌抑素、转化生长因子-β（TGF-β）、激活素、IL-6、睫状神经营养因子（CNTF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）作为抑制剂，都属于分泌蛋白。

外泌体是由包括肌肉细胞在内的大多数细胞分泌的小囊泡。最近的研究表明，外泌体在细胞通讯中发挥关键作用，通过转移生物活性分子（蛋白质、脂质、mRNA、microRNA）来调节同质和异质受体细胞的功能和分化。例如，作者前期研究表明，成骨细胞衍生的外泌体可以将microRNA载入间充质干细胞，并通过激活Wnt信号通路促进靶细胞的成骨。

考虑到外泌体在细胞通讯中的作用，作者推测外泌体microRNAs是否也可以作为调节骨代谢的特殊“肌细胞因子”。在这项研究中，作者首次提供体外研究证据，证明成肌细胞衍生的外泌体可以进入成骨细胞，促进成骨细胞分化。此外表明miR-27a-3p是这种效应的关键外泌体成分。

研究方法

• 细胞培养与成骨诱导分化：小鼠C2C12细胞培养富集外泌体，MC3T3-E1被诱导骨分化。
• 外泌体富集及miRNA-seq：C2C12细胞外泌体富集，进行miRNA-seq（n=4）。
• 外泌体标记与MC3T3-E1细胞共孵育：观察摄入现象。
• 敲低C2C12中 miR-27a-3p表达，进行RT-PCR定量。
• RT-PCR定量成骨分化标记基因，ALP（碱性磷酸酶）活性测量和茜素红染色。
• MC3T3-E1 Western blot及免疫荧光：验证APC及β-catenin活化。

研究结果

1、C2C12成肌细胞分泌的外泌体可以进入前成骨细胞MC3T3-E1，促进其成骨分化。

将外泌体标记与MC3T3-E1共孵育，观察到这类外泌体（myo-exosomes）能够被MC3T3-E1细胞摄入。并且MC3T3-E1细胞的成骨分化也能够被促进，表现为增强的ALP活性，基质矿化增强，与标记基因ALP/OCN/RUNX2表达上调。对C2C12成肌细胞分泌的外泌体进行小RNA测序，基于测序结果，鉴定出来的miRNA进行共有分析，其中有12个miRNA分子高表达，一些功能被证实的与成骨相关的miRNA分子，例如miR-27a-3p也包括在内。

2、外泌体的miR-27a-3p在成骨分化中发挥重要作用。

当MC3T3-E1细胞摄入C2C12外泌体后，miR-27a-3p的表达水平升高。进一步敲低miR-27a-3p的表达，C2C12外泌体没有起到促进MC3T3-E1成骨分化的作用。这一结果表明了成肌细胞外泌体依赖于miR-27a-3p发挥促成骨作用。

3、C2C12外泌体改变 MC3T3-E1细胞中miR-27a-3p的表达，靶向APC从而激活Wnt/β-catenin pathway。

在成骨分化过程中，Wnt/β-catenin pathway起到重要作用，APC作为该通路的负调节蛋白已被证实直接受miR-27a-3p调控。MC3T3-E1摄入外泌体后，APC的表达受到明显抑制，β-catenin的表达显著升高且被激活。当miR-27a-3p敲低后，外泌体对APC-β-catenin pathway没有影响。

总结

成肌细胞外泌体可以进入前成骨细胞，并促进成骨分化。该效应依赖于外泌体中的miR-27a-3p释放，随之引起前成骨细胞中的β-catenin通路活化。文章研究对肌因子调控肌肉-骨互作提供了新见解，并且强调了成肌细胞外泌体miR-27a-3p作为肌肉相关的异常骨重建的指标和互作靶标的可能性。

参考文献：

Xu Q, Cui Y , Luan J , et al. Exosomes from C2C12 myoblasts enhance osteogenic differentiation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts by delivering miR-27a-3p. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018.

 

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