J Hazard Mater丨全长转录组解析蜈蚣草砷超富集调控机制在植物修复中的潜在应用

2019年1月23日Journal of Hazardous Materials在线发表中国科学院植物研究所何振艳研究团队“Potential use of the Pteris vittata arsenic hyperaccumulation-regulation network for phytoremediation”研究论文。本文通过三代全长转录组、二代转录组和蛋白组联合分析，阐述了蜈蚣草砷超富集调控机制。

研究背景

砷是一种自然界广泛存在的有毒类金属元素。随着人类和科技的发展，农药、采矿等行为对土壤造成了严重的砷污染。砷可通过食物链从土壤富集到人体中，对人体造成极大的伤害。为保护人类健康，维护粮食安全，亟需对土壤砷污染进行治理。近年来，以砷超富集植物蜈蚣草为基础的植物修复技术，为砷污染土壤的修复提供了新的低成本和环境友好的治理策略。
蜈蚣草是一种砷超富集的模式作物，具有极强的砷抗性和富集能力。据统计，蜈蚣草地上部分砷富集量可达23 g/ kg，且不影响其正常生长，是价值极高的植物修复材料。目前，蜈蚣草组学信息的缺乏已成为其砷超富集机制研究的瓶颈，超富集过程关键分子元件的未知，极大的限制了植物修复技术的研发和推进。

研究材料及方法

研究材料：蜈蚣草孢子体收集于湖北武汉，并在无砷培养土中长至10cm左右。
研究方法：使用2 mM As(III) (NaAsO2)或2 mM As(V) (NaH2AsO4)作为试验组进行水培处理，24h后分别采集根部和地上部进行测序。
测序平台：北京百迈客生物科技有限公司Illumina及Pacbio测序平台。

研究结果

1 构建蜈蚣草“全长转录组-液泡膜蛋白质组”数据库
SR-uXRF扫描结果显示，使用As(III)/As(V)处理24h后，蜈蚣草可迅速吸收并将砷积累到体内。本研究使用PacBio RS-II 测序平台，构建1-2、2-3和3-6 Kb三个文库共8个cell，其测序长度最长达50kb，平均长度3,111bp。使用Illumina 二代测序平台共计获得521M双端reads,平均长度为924bp。通过蛋白质组学测序分析，共计获得13,595个液泡膜肽段，可以匹配到转录组数据库中的1,512个转录本。与NGS测序技术相比，使用Pacbio进行三代测序可获得更为完整的转录本，得到的转录本数量少但平均长度更长。使用二代数据对三代数据进行校正后其转录本的质量从0.598提升至0.906。综上所述，在使用As(III)/As(V)处理后，共计获得 69,615转录本，381个lncRNAs，1,482个可变剪切及1,512个可匹配转录本的肽段。将以上信息进行整合，构建了蜈蚣草“全长转录组-液泡膜蛋白质组”数据库。

图1 不同处理下蜈蚣草砷累积水平及“全长转录组–蛋白组”数据库构建工作流程

2 As(III)/As(V)处理条件下蜈蚣草基因表达谱
对不同处理不同组织部位进行两两比较（CKS-As(III)S、CKR-As(V)S、CKS-As(III)R和CKRAs(V)R），共计获得4,601个差异表达基因。通过K-means算法进行富集分析，6个cluster中的共2,997（65.1%）个DEGs在根和地上部出现相反的表达模式：其中k1、k3、k4和k6以地上部表达模式为主，其生物学功能包括光合作用等；而k2和k5以根部表达模式为主，参与ABC转运等功能。
WGCNA组分分析可知，粉色和紫色模块的地上部与As(III)处理显著相关，根部模块中绿色和紫色模块与As(III)处理显著相关，粉色模块与As(V)处理的地上部显著相关，棕色模块与As(V)处理的根部显著相关。通过KEGG富集分析发现，在所有的砷处理样品中，均富集到GSH代谢（ko00480）和ABC转运受体（ko02010）两个通路。内质网蛋白质加工过程（ko04141）主要富集在砷处理的根部样品中。因此，这些通路可能在蜈蚣草的砷超富集过程中扮演重要作用。

图2 K-means聚类及WGCNA组分分析

图3 液泡膜潜在的砷转运蛋白的鉴定及表达模式分析

4 蜈蚣草砷抗性通路的鉴定
本研究表明，错误折叠蛋白降解和GSH代谢途径在砷处理相关模块中富集，为蜈蚣草的砷抗性机制提供了新思路。
内质网蛋白加工通路（ERAD, ko04141）在所有与砷处理相关的模块中显著富集程度最高。重金属会导致细胞内的蛋白错误折叠而引起内质网的应激。内质网蛋白降解通路（ERAD）和泛素蛋白酶体通路（UPP）可降解错误折叠蛋白的合成而维持细胞健康。在进行砷处理后，所有与内质网应激相关基因并未被激活，而参与ERAD和UPP通路的基因则表达量上调，且根部基因表达水平高于地上部。根部是直接与环境中的砷接触部位，其错误蛋白降解能力的提高，可保证根部的正常代谢，进而赋予其较强的砷抗性。
GSH代谢通路也在所有的砷处理样品中富集。在植物中，GSH可作为抗氧化剂阻止ROS损伤。在本研究中，GSH合成的两个关键酶GSH1和GSH2并未明显受到砷处理的影响，而GST转录本的表达量则在砷处理后显著上调。GST可通过谷胱甘肽与亚砷酸盐结合而介导砷-硫醇化合物的形成。蜈蚣草有着很强的砷-GSH络合物的合成能力，但其络合物量却很少，因此有可能存在高效的“As(GSH)3络合-区隔化-降解”过程。一旦As(GSH)3进入液泡而GST不足，由于砷-硫醇类化合物的高度不稳定性，可能发生不可逆降解，从而使得As(GSH)3含量很低。而蜈蚣草高效的‘砷络合-区隔化’系统能阻止细胞质内的砷损害，进而增加蜈蚣草对砷的抗性。

图4 ERAD通路和GSH代谢过程

5 蜈蚣草砷超积累调控相关非编码RNA（lncRNA）及可变剪接鉴定
本研究共鉴定到1,482个可变剪接事件，并分为六类包括：内含子保留（RI）、外显子跳跃（SE）、最后外显子可变剪切（AL）。第一外显子可变剪切（AF）、3’端可变剪接位点（A3）和5’端可变剪接（A5）。WGCNA分析结果共分为四个模块（橙色、绿色、蓝色，灰色）。在地上部，所有样本都与橙色模块相关，而在根部，绿色模块与As(III)R显著相关，蓝色模块与AS(V)R显著相关。对不同模块进行KEGG富集分析得知，内质网蛋白质加工通路和GSH代谢两个最重要的通路，显著富集在绿色模块。通过PCR对相关可变剪切进行鉴定，结果表明可变剪切极大的丰富了转录本的数量，在错误折叠蛋白降解过程和GST的表达上起调控作用。

图5  可变剪切的表达模式及功能分析

    此外，本研究还鉴定到381个不同长度的lncRNA。通过WGCNA进行lncRNA与靶基因间的共表达和相关性分析得知：来自AS(III)S处理组的lncRNAs及其靶基因主要与橙色模块相关，CKS主要与绿色模块相关，而来自根部的则与深灰色模块相关。“谷胱甘肽结合”条目富集在深灰色模块，表明蜈蚣草根系中的lncRNA可能参与了GSH结合的调控。通过qRT-PCR进行定量分析可知，根中与GST相关的lncRNA-mRNA表达水平呈正相关，表明lncRNA和其GST靶基因间存在调控作用从而保证根部的抗砷性。

图6 lncRNAs的表达模式及功能分析

总结

 

    三代测序技术持续火热，但是如何利用该技术解决相应的科学问题，需进行深入思考和严密的研究技术路线设计。本篇文章将三代转录组学技术与蛋白质组学结合，并不只停留于表面数据的罗列和概述，而是通过层层推进与数据的深度挖掘，围绕关注点（砷超富集机制）进行多角度论证，对蜈蚣草砷超富集调控机制的阐明奠定了重要基础，也为植物修复工程植株的培育提供了潜在的分子元件。

小编寄语

全长转录组测序利用Nanopore或Pacbio三代测序平台进行的测序，可借助其超长读长优势，无需组装，直接获得全长转录本，准确鉴定基因的可变剪接、APA、融合基因、基因家族和非编码RNA等信息。此外，全长转录组和蛋白组联合分析是近两年研究热点，一方面可以构建蛋白搜索数据库，全面准确地对蛋白进行鉴定和定量；另一方面对可变剪切事件进行相互验证。

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百迈客自2015年率先引进PacBio三代测序平台，2018年8月牛津纳米孔公司与百迈客公司达成长期合作，拥有MinION、GridION X5和PromethION三种型号全套纳米孔测序仪。至今已积累了丰富的项目经验，目前成功发表8篇全长转录组文献，先后发表在《Plant Biotechnology Journal》、《Journal of Hazardous Materials》、《Scientific Reports》、《Fish & Shellfish Immunology》等国际知名期刊，是国内发表全长转录组成功案例最多的公司，已发表文章研究物种分别有杨树、蜈蚣草、甘薯、野生甘薯、兔子、跳甲、花羔红点鲑和辣椒，覆盖领域分别为林木、哺乳动物、昆虫、水产和作物等。