茅台酒发酵中的致癌物(EC)控制菌【百迈客合作案例】

 

英文题目:Ethyl Carbamate Formation Regulated by Lactic Acid Bacteria and Nonconventional Yeasts in Solid-State Fermentation of Chinese Moutai-Flavor Liquor

中文题目:茅台酒固态发酵中乳酸菌和酵母菌对氨基甲酸乙酯(EC)的合成控制

期刊名称:Journal of Agricultural and Food Chemistry

影响因子:3.41

合作单位:江南大学 食品科学与技术国家重点实验室

研究背景

氨基甲酸乙酯(C2H5OCONH2,EC)在发酵食品和饮料中普遍存在,面包、红酒、奶酪、酱油和醋等都有EC,EC具有潜在致癌和诱变效应,2010年,世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)已经将EC列为2A级致癌物,传统发酵酒类饮料是EC的重要来源,因此,EC对人体的健康风险值得关注。固态发酵(SSF)是传统酒精饮料生产中常见的一种工艺,该工艺可改善食品口感和风味,中国茅台酒(53°)的生产就是由多种微生物群落驱动的典型传统发酵饮料SSF工艺。微生物的生长和代谢是影响白酒发酵的关键因素,微生物对原料的分解促进了菌群的生长和发酵,乳酸菌代谢物也可以抑制致病菌和腐化菌的生长。目前,混合培养接种法已成为提高发酵白酒饮料质量和产量的前途技术,然而,中国白酒中的EC调控研究仍然滞后。研究表明,尿素主要通过酵母菌的精氨酸代谢途径产生,精氨酸代谢和尿素循环产生的瓜氨酸和尿素可以与乙醇自发反应生成EC。尿素、瓜氨酸以及氨甲酰磷酸等EC前体化合物促进了酵母菌和乳酸菌(LAB)的EC生产试验的发展。本研究使用了16S扩增子测序、全转录组测序以及代谢组学技术,探究了合成和降解EC前体(特别是尿素)的微生物群落在发酵过程中的氮调节作用,建立了关键微生物与尿素含量的关系,为SSF过程中EC的微生物合成调控提供了重要依据。

试验方法

1.  样本收集:中国西南地区某茅台酒制造厂,收集同一批次两个阶段(堆积和发酵阶段)的样品。堆积阶段的谷物混合物地面堆放1、2和3天;发酵阶段的谷物混合物在厌氧环境中发酵0、5、10、15、20、25、30和32天。从堆积(发酵)池的底部至顶部取3份样品后均匀混合(使样品具有代表性),每份取500g置于无菌袋,-80℃密封保存。
2.  微生物多样性分析:16S rRNA V3-V4(338F/806R),Illumina, Mothur、UCHIME和QIIME等软件进行生信分析,物种注释数据库为GREENGENES。3.  全转录组分析:Illumina Hiseq 2500,Trinity和DIAMOND等软件完成生信分析,功能注释使用KEGG数据库。4.  EC和前体化合物检测:气象色谱串联质谱仪(GC-MS),离子源电压70eV,选择离子监测模式(m/z 62),内标为丙基碳酸酯,柱箱温度模式(80℃ 2min,10℃/min升至230℃),毛细管分离柱(长60m,内径0.25mm,厚度0.25μm),进气温度250℃,离子源温度230℃,不分流模式,1μL进样量,三氟乙酰胺(MTBSTFA,尿酸、精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸的衍生化试剂)。

5.  尿素和精氨酸代谢试验:分离发酵物中的目标菌株,rDNA测序分子分类学方法鉴定分离菌株,使用白酒发酵(中国)过程中的几种主要微生物来模拟共培养体系。固态培养基的制备:高梁(250g),热水(350mL,70-80℃),浸透24h,121℃灭菌20min;根霉曲霉菌(Rhizopus oryzae G4)孢子悬液(104 CFU/g)添加至固态培养基,将精氨酸(300mg/L)和尿素(200mg/L)添加至30℃孵育1d后的糖化培养基(精氨酸和尿素的浓度为最终浓度),接种4种酵母菌和6种乳酸菌(各105 CFU/g),600nm波长检测30℃孵化5d后的培养基中的精氨酸和尿素含量,未接种的培养基作为对照组。

重点结果与讨论

1.  茅台酒发酵过程中EC与前体化合物的关联在堆积和发酵阶段中,EC随着乙醇产量的增加而增加(图1a);3种可能的EC前体化合物(尿素、氰化物和瓜氨酸)产量先增加(0-15 d发酵阶段)后减少(15-32 d发酵阶段),其中,尿素的产量最高且变化幅度最大(图1b);发酵早期阶段(0-15d),尿素与EC产量成比例地增加,EC含量与氰化物(R2=0.192)和瓜氨酸(R2=0.076)的相关系数较低,与尿素的相关性较高(R2=0.722,p<0.01)(图1c)。研究表明,尿素在细胞中的过度积累会造成细胞中毒,因此,发酵液中尿素含量的明显增加,可能由细胞的尿素外排导致。精氨酸的含量在堆积阶段(D1-D3)迅速增加,在发酵早期阶段(F0-F15)又迅速降低(图1d),尿素与精氨酸的含量变化呈显著的负相关性(R2=0.956,p<0.01),表明白酒早期发酵中的尿素主要是由精氨酸的代谢产生的。

图1. 茅台酒发酵过程中EC和前体化合物的代谢变化

2.  全转录组分析与尿素有关的酵母菌和乳酸菌

茅台酒发酵阶段的微生物代谢途径中,KEGG数据库共注释到64394种功能基因,其中13.99%(9003)用于维持微生物的基本生存(如核糖体、细胞周期和RNA转运),其余86.01%参与不同的代谢途径,包括碳代谢通路(27788,43.18%)和氮代谢通路(20667,32.12%)等,毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)和乳酸菌属(Lactobacillus)是微生物发酵的氮代谢过程中主要的功能菌。

3.  乳酸菌能够利用精氨酸和降解尿素

茅台酒发酵过程中,精氨酸脱亚胺酶(ADI)、鸟氨酸转胺甲酰酶(OTC)和氨基甲酸酯酶(CK)是精氨酸降解途径的关键酶,精氨酸是微生物的能量来源,乳酸菌与酵母菌可以同时降解精氨酸,导致酵母菌在尿素循环途径产生的尿素减少(图2a)。早期发酵阶段,发酵液中的乳酸菌多样性较高,后期又逐渐降低,乳酸菌的相对丰度在后期达到90%以上(图2b)。分离出的6种优势乳酸菌中,L. fermentum JSA30、L. plantarum JD19、L. pontis JSB7、L. buchneri N5和L. casei X1对精氨酸的降解能力较强(0.5 mmol/L),而L. diolivorans 2−10较弱(0.06 mmol/L)(表1)。研究表明,L. fermentum JSA30合成的脲酶也具有尿素降解作用。从上述结果可以看出,乳酸菌在SSF系统中能与酵母菌竞争利用精氨酸,乳酸菌对尿素的降解也可以降低EC在发酵液中的含量。此外,茅台酒发酵液中的多种乳酸菌(L. plantarum、L. fermentum和L. buchneri)与已报道的多种发酵食品中的相似,本研究分离得到的菌株能够为其他发酵食品的微生物功能研究提供参考。

表1. 优势乳酸菌对精氨酸和尿素的代谢

图2. 茅台酒发酵过程中微生物组成和功能变化。

a:氮代谢(KEGG)相关乳酸菌和酵母菌的FPKM;b:乳酸菌在“属”水平的丰度变化。

4.  非传统型优势酵母菌能够调节尿素的合成

茅台酒早期发酵阶段,尿素是尿素循环途径的主要产物(图2a),毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)是尿素合成的潜在功能菌。茅台酒的SSF系统存在两种尿素降解途径,尿素羧化酶(UCA)和脲基甲酸水解酶(AH)来源于毕赤酵母和接合酵母(图3A 3B),ATP非依赖脲酶(URE)来源于裂殖酵母(图3C),发酵后期(15-32d)尿素产量的降低与UCA、AH和URE的基因表达紧密相关(图3D)。

采用纯培养方法检验了谷物发酵过程中的4种酵母菌,发现它们的精氨酸和尿素降解能力存在差异(表2)。酿酒酵母(S. cerevisiae C-3)是传统白酒发酵中生产乙醇最重要的菌,该菌的精氨酸酶(CAR1)基因表达能够产生大量的尿素和鸟氨酸,该菌的尿素合成能力较强(2.64 mmol/L)但尿素降解能力较弱(0.56 mmol/L),大量的尿素被酿酒酵母排出胞外,导致发酵液中尿素含量增加;与S. cerevisiae C-3相比,接合酵母(Z. bailii C-7)的尿素合成能力较弱但尿素降解能力较强;毕赤酵母(P. kudriavzevii C-16)的尿素合成能力最弱;裂殖酵母(Sc. pombe C-11)的尿素降解能力最强(2.03 mmol/L)。因此,3种非传统酵母菌Z. bailii C-7、P. kudriavzevii C-16和Sc. pombe C-11可以降低白酒发酵中尿素的产量。

表2. 优势酵母菌对精氨酸和尿素的代谢

图3. 尿素降解通路(KEGG)的基因表达(FPKM)。

A:尿素降解为脲基甲酸盐(allophanate)的代谢通路基因表达;B:脲基甲酸盐降解为氨(NH3)的代谢通路基因表达;C:尿素降解为氨的代谢通路基因表达;D:白酒发酵过程中的尿素产量变化。

总结

本文旨在鉴定茅台酒的固态发酵过程中与氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate,EC)发酵前体化合物相关的特异微生物。结果发现,EC在发酵过程中的含量与尿素显著正相关(R2=0.772,p<0.01);全转录组测序和纯培养分析发现,尿素的合成与降解在物种、功能基因水平都有差异;乳酸菌(Lactobacillus spp)在精氨酸脱亚胺酶途径能与酵母菌(yeasts)竞争降解精氨酸,且大部分乳酸菌“种”能降解尿素;相对于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae),毕赤酵母菌(Pichia)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)和接合酵母菌(Zygosaccharomyces)的尿素合成较少;鉴定出尿素羧化酶、脲基甲酸水解酶和ATP非依赖尿素酶等罕见的尿素降解途径。结果表明,固态发酵过程中的EC前体化合物能够被乳酸菌和非传统型酵母菌有效控制。

点击下面按钮,下载本文英文文献全文。

点评

尿素是微生物代谢产物,尿素与乙醇的结合导致了致癌物氨基甲酸乙酯的增加,乳酸菌通过精氨酸脱亚胺酶代谢途径而非酵母菌的尿素循环途径竞争性降解精氨酸导致尿素的产量下降,3种酵母菌能有效降解尿酸并合成较少的尿酸,总之,氨基甲酸乙酯的前体物质能被乳酸菌和非传统酵母控制。

如果您的科研项目有问题,欢迎点击下方按钮咨询我们,我们将免费为您设计文章方案。

 

最近文章