在盐刺激下对耐盐拟诺卡氏菌YIM 90087T进行转录组学和四氢嘧啶分析

回顾2018，百迈客转录调控项目文章收获颇丰：据不完全统计，已突破百篇，累积影响因子300+，涉及转录组、全转录组、非编码RNA、全长转录组、蛋白组、代谢组、降解组和原核转录组等。本次项目文章分享中，我们一起走进微小生物世界，去看一看里面的大乾坤~

研究背景

拟诺卡氏菌种是从盐湖或碱性环境中分离出来的，其中有约三分之二的菌种嗜盐或耐盐。在高盐环境下，拟诺卡氏菌可通过加固细胞壁和积累渗透因子等多种方式而使自身得以生存。盐刺激条件下，渗透因子的累积可使得菌体在不影响其基本细胞进程和常规代谢的情况下而保持菌体渗透平衡。其中在自然界含量最多的渗透因子便是四氢嘧啶，其可促进蛋白折叠，并保护酶、核酸、抗体等生物分子，使细胞可应对多种压力环境。在所有的拟诺卡氏菌种中都有参与四氢嘧啶合成的相关基因。

材料方法

试验材料：菌种（Nocardiopsisgilva YIM 90087^T）

试验内容：

1、使用不同盐浓度（0~15%）处理，观察N.gilva YIM 90087^T的形态学变化、增殖、四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶检测，进行表型测定

2、提取中期对数期YIM 90087^T菌体RNA，进行转录组测序

测序平台：北京百迈客生物科技有限公司 Illumina Hiseq

研究结果

1、盐含量对N. gilva YIM 90087T的形态学和增殖情况影响

随着盐浓度的增高，菌落颜色由黄色变为白色，且在5%的NaCl盐溶液中生长最佳，盐浓度高于或低于该浓度，其生长速度均会下降。

 

图1、菌体表型观察及生长曲线

2、差异表达分析

对菌种进行二代测序，筛选FDR<0.01，Fold Change≥2的基因为差异表达基因，并使用COG、GO、KEGG、Swissport和NR数据库进行注释分析。通过COG分类，共获得25个COG组别，其中氨基酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢是其主要组分。DEGs被分布在34个GO term里，其中包括细胞组分、分子功能和生物过程三大类。与此同时，三个比较组（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）差异表达基因分别富集到77、32和90条KEGG通路中，其中ABC转运受体，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢在盐刺激下扮演相当重要的角色。尤其在最大耐受度的NaCl盐环境里，参与ABC转运受体通路的四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶基因、甜菜碱基因和四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成基因表达量都显著提高。

图2、三个比较组的（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）COG注释

3、N. gilva YIM 90087^T菌种ect基因集的遗传组成

对四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成基因ectABCD进行种属分析。其中在18个拟诺卡氏菌系中存在2个常见的ectABCD基因簇类型。ectABC属于一个基因簇，而ectD则位于基因组的其他位置（type A, 15 strains），又或者ectABCD归属于相同的基因簇（type B, 3 strains）。此外，在N. potens DSM 45234和N.prasina DSM 43845菌系中发现至少一个ectAB或ectD基因。然而，在N.gilva YIM 90087^T中，基因簇类型却与其他菌系显著不同。ectA基因完全与ectBCD基因簇分开，且ehuABCD（四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶ABC转运受体基因）位于ectD基因的下游。

图3、四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成基因基因簇

4、参与四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成和转运基因的表达情况

对不同盐环境下的参与四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成和转运基因的表达情况进行分析，发现随着盐浓度的升高，参与四氢嘧啶合成的基因有不同程度的上调，尤其在15%的盐浓度中最显著。与其他基因不同的是，ectD基因从5%到10%和10%到15%盐浓度下出现两次上调。在N. gilva YIM 90087^T中发现有两个特殊的ABC受体基因（ehuABCD和 proXWV）参与四氢嘧啶的转运，并随着盐浓度的升高而发生变化。ehuABCD表达情况与盐浓度在大于5%以上时成正相关，而proXWV的表达量变化在耐受盐浓度环境中无变化。有趣的是，ehuABCD和proXWV基因在最大耐受盐浓度中表达活性最高。

表1、在不同盐浓度刺激下四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成与转运基因的表达情况

5、N. gilva YIM 90087^T中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的累积

使用HPLC对四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶含量进行检测，结果发现，胞内这两种物质的含量变化会随着时间累积，且积累程度随着NaCl浓度的升高而增加。值得注意的是，羟基四氢嘧啶在0或5% NaCl浓度下很难被合成；而48h后，在10%和15%的NaCl培养基中被检测到。此外，这两种物质含量均会随着培养时间的增长而增加。96h后，在15%的NaCl浓度培养下，四氢嘧啶（33.14 mg/g CDW）和羟基四氢嘧啶（1.17 mg/g CDW）达到最高水平。在10%和15%的盐浓度环境下，四氢嘧啶的含量要比羟基四氢嘧啶的含量分别高42.6和28.3倍。这些结果表明，四氢嘧啶会在N. gilvaYIM 90087^T的胞内累积。

除此之外，对胞外的四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶含量进行检测并发现大量的四氢嘧啶被释放到细胞外。96h后，在0、10%和15%的盐浓度环境下，分别释放了89.20%、92.46%、91.99%和71.09%的四氢嘧啶。在10%和15%的盐浓度环境下，有99.31%和99.08%的羟基四氢嘧啶被释放到胞外。在15%的盐浓度环境下，四氢嘧啶的转运能力显著增强，而羟基四氢嘧啶的转运能力则随着浓度的增加未出现显著变化。此外，研究表明，将四氢嘧啶转化为羟基四氢嘧啶的能力会随着盐浓度的增加而增强，在15%的盐浓度环境下，有50%的四氢嘧啶转化为羟基四氢嘧啶，并在10%和15%的盐浓度环境下，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的胞外含量最高。

图4、N. gilva YIM 90087^T菌种中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的产生统计

6、外源四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶对N.gilva YIM 90087^T生长的影响

在盐刺激下，添加外源的四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶会促进菌种的生长速度。在最适宜的盐浓度环境下，添加四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶会轻微促进OD₆₀₀值，而在高浓度盐环境下，外源物会显著促进OD₆₀₀值。其中添加外源羟基四氢嘧啶对菌种的生长速度促进作用优于外源四氢嘧啶。

7、大肠杆菌中四氢嘧啶累积

将重组质粒转入大肠杆菌中，发现在15%的NaCl缓冲液中，四氢嘧啶很难产生，并在0%的缓冲液中检测到少量四氢嘧啶。在10%和15%的盐浓度环境下，四氢嘧啶的合成速率分别在24h和48h中显著下降，其最大合成速率为[0.5 mg (g CDW)⁻¹ h⁻¹]，而最终产出[28.85 mg (g CDW)⁻¹] 。

总结

本文通过对N.gilva YIM 90087^T在不同盐浓度环境下的综合分析，发现盐刺激可导致菌落颜色发生变化。添加外源的四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶，在高浓度盐环境下，可对N. gilva YIM 90087^T起到保护作用。转录组学分析发现，四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的合成和累积可调控渗透压力，并随着NaCl浓度的升高合成量增大。

 

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