浅谈 lncRNA的研究思路

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长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200 nt的RNA分子,位于细胞核或胞质内,lncRNA一直以来都是科研领域的热点,吸引着众多研究者的目光。长链非编码RNA按照其来源可分为Antisense lncRNA (反义长非编码RNA),Intronic transcript (内含子非编码RNA),Long intergenc noncoding RNA(lincRNA),Promoter-associated lncRNA(启动子相关lncRNA),UTR associated lncRNA(非翻译区lncRNA)五种类型。lncRNA在转录前、转录水平与转录后水平上均具有重要作用。在整个基因组转录产物中,lncRNA所占的比例远远超过编码RNA所占的比例,与人类和动物相比,植物lncRNA研究仍处于起步阶段,植物lncRNA的研究可能揭示控制植物生长和分化的未知新机制,lncRNA在植物开花、雄性不育、营养代谢、生物和非生物胁迫等多种生物过程中起着调节因子的作用。随着高通量测序技术的发展,越来越多的lncRNA被鉴定出来,但具体的作用与功能仍然不是很清楚,因此lncRNA的研究领域依然是一片非常广阔的神秘区,具有极大的研究价值。

lncRNA的研究主要分为三大步骤:

 

  • 1、lncRNA的筛选
  • 2、lncRNA的验证
  • 3、lncRNA的功能研究

1、lncRNA的筛选

基于链特异性建库的RNA-seq能够对不同组织或样本的lncRNA进行测序,通过对转录本编码潜能进行筛选,判断其是否具有编码潜能,从而可以判定该转录本是否为lncRNA,并识别不同样品(或样品组)之间显著差异表达的基因或lncRNA。

4种lncRNA筛选方法维恩图


差异表达lncRNA聚类热图

2、LncRNA的验证

通过测序结果确定相关lncRNA后,可以通过NONCODE或者lncRNAdb等网站进一步了解lncRNA的相关信息,比如lncRNA的长度,染色体所在位置与特异性表达信息。

lncRNA的全长序列一般通过RACE实验来获得,5’RACE获取5’全长,3’RACE获取 3’全长,最终拿到完整的lncRNA序列。


RACE实验扩增lncRNA[1]

lncRNA的表达分析可以通过定量PCR或者Northern blot验证,在不同组织或样本中检测表达差异,为筛选研究目标lncRNA打下基础。这里还要提一下lncRNA的分子定位分析,这些非编码RNA的定位分析对深入了解他们的功能是至关重要的,因为这可能决定了lncRNA的调控机制。众所周知,lncRNA可以在转录水平或转录后水平来调控基因的表达,当lncRNA位于细胞核内时,是在转录前或转录水平上来影响基因的表达,因此在这种情况下再提出当前研究较火热的ceRNA机制就不是那么合理了。对于lncRNA定位信息,可以通过查询RNALocate数据库或者相关分子实验确定。


lncRNA的定位研究[2]

3、LncRNA的功能研究

通过高通量筛选出lncRNA只是研究的第一步,想要发高分文章,就必须对lncRNA的功能进行深入的探索。最基本的研究就是构建lncRNA超表达载体或通过siRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA,直观地展现lncRNA具有的生物学功能。在明确了lncRNA具有的生物学功能后,就要从分子机制上解析其如何发挥的作用,无外乎三点:1)lncRNA与RNA相互作用,这里主要指的是lncRNA对其靶基因的调控;2)lncRNA与蛋白相互作用,RIP是研究RNA蛋白相互作用的重要手段,利用RIP可以研究在体内蛋白是否与lncRNA发生相互作用;3)lncRNA结合DNA序列,这是位于核内的lncRNA发挥调控作用的一种机制。

lncRNA超表达株系具有干旱抗性[2]

lncRNA在最初研究阶段,普遍不认为其具备编码能力,但最近几年相继有文章报道相关lncRNA能通过编码小肽来发挥作用,一时间lncRNA编码话题再次成为热点。对于判断lncRNA是否具备编码潜能,首先要看该lncRNA是否具有核糖体结合位点与开放阅读框,满足这两个先天条件后,还要通过多肽鉴定的分子实验来进行验证。

lncRNA依然是科研领域热点之一,现在来说,简单筛选某一物种的lncRNA很难发表高分文章,下游功能验证研究越来越被重视,对文章影响因子有期待的老师,做好下游实验一定会给文章增光添彩。

参考文献:

[1] Gong,Chen guang,Li,et al.A Long Non-coding RNA,LncMyoD,Regulates Skeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation[J].Developmental Cell,2015.

[2] Tao Qin,Huayan Zhao,Peng Cui,Nour Albesher,Liming Xiong.A Nucleus-localized Long Non-Coding RNA Enhances Drought and Salt Stress Tolerance.Plant Physiology,2017.

 

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