蛋白组研究中的iTRAQ技术

一万年太久，只争朝夕，就让一个亿随风去吧，新的一年我们不仅饺子要吃饱，文章也要发表，蛋白组文章来一波~

1.蛋白组研究简介
蛋白质是生理活动的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。对细胞或组织的全蛋白质表达谱进行系统分析的蛋白质组学，是目前发展迅速的组学研究之一，已被广泛用于生长发育、抗逆性状改良、免疫互作、药物作用机制、生物标志物发现等的研究。
所谓“工欲善其事，必先利其器”，科学研究也一样，下面就给大家介绍一下已被广泛应用到蛋白组研究中的iTRAQ技术。

2.iTRAQ技术介绍
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。

图1 iTRAQ技术简介

iTRAQ试剂由三部分组成：报告基团；质量平衡基团和肽反应标记试剂基团，可形成4种或8种相对分子质量均为145的等量异位标签。

图2 iTRAQ试剂标记肽段

iTRAQ试剂标记酶解后的肽段，可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在串联质谱中，报告基团断裂下来产生报告离子，根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

3.iTRAQ文献
据不完全统计，通过iTRAQ技术进行大规模蛋白质研究，发表的文章已达到2500+，通过iTRAQ技术进行蛋白组研究发表文章，接收率还是非常高的~下面iTRAQ文章简介来一波~

01 抗逆性状改良
植物在遇到各种环境侵害(如高温、低温、干旱、高盐、高渗透压、臭氧及机械损伤等)时会发生应激保护措施。这些胁迫可以引起大量的蛋白质在种类和表达量上的变化,通过对耐旱能力不同的小麦品系进行定量蛋白质组学研究可以了解小麦对胁迫的适应机制。

实验设计：
小麦抗旱品种Opata，小麦耐旱品种Nesser，两个品种。
取正常培养及ABA处理条件后的根，共4组。
测序策略：
iTRAQ（三个生物学重复，采用三个iTRAQ4标）、LC-MS/MS、qRT-PCR。
研究结果：
1、利用iTRAQ方法共鉴定出1656个蛋白，其中936个为显著差异蛋白。
2、从差异分析结果中，筛选出抗旱能力不同的小麦中特有蛋白（同时对ABA处理有响应）；通过qRT-PCR的方法进行验证。
文章亮点：
除了对相同作物不同品系与处理条件进行的蛋白组比较研究，本研究的小麦蛋白组数据库采用多个不同的小麦数据库，极大提升了蛋白鉴定数量。

02 动物生长发育
猪肉的生长速率和肉质是其重要的两个经济学指标，由多种基因和生物学通路调控，通过蛋白组学研究可以充分了解动物生长发育相关蛋白，为品质改良打下基础。

实验设计：
中国本土品种：藏猪（TP）、滇南小耳猪（DSP）。
西方引进品种：约克猪（YY）和长白猪（LL）的背最长肌样本。六月龄取样，以寻找参与猪肌肉生长和脂肪沉积的关键蛋白。
测序策略：
iTRAQ（两个生物学重复，采用一个iTRAQ8标）、LC-MS/MS、PRM分析技术。
研究结果：
作者应用iTRAQ对四组样本进行蛋白质组学分析，鉴定出了4815个多肽，对应969种蛋白。在这之中有288种为差异性表达蛋白（DEPs），其中169种蛋白在TP-DSP组上调，119种下调。
作者随即对这些DEPs分别进行了GO和KEGG分析，筛选出了28种与肌肉生长相关和15种与脂肪沉积相关的蛋白。
文章亮点：
本文最后应用PRM对iTRAQ的分析结果进行验证，由于此方法需要目标蛋白有样本中唯一的多肽作为标记，因此只对其中的12种蛋白进行了PRM分析，结果均与iTRAQ一致，提高了实验结果的可信度。

03 免疫互作
玉米作为世界范围内主要作物,受昆虫攻击造成巨大的生产损失。文章旨在研究玉米受食草昆虫攻击的响应机制，着重分析与机械损伤相比，食草昆虫的口腔分泌物对植物-昆虫之间互作所起的作用。

实验设计：
W组：未处理的玉米叶片；W+W组：20 μL水处理V3期玉米机械损伤的叶片；
W+OS 组：20μL口腔分泌液处理V3期玉米机械损伤的叶片。
测序策略：
转录组测序（三个生物学重复）：W+W组和W+OS 组，处理1.5h、6h。
iTRAQ蛋白定量技术（三个生物学重复）。
靶向代谢组：激素表达水平检测，筛选测序时间点；非靶向代谢组。
研究结果：
4406个差异表达的基因中，4142个基因没有检测到相应的蛋白表达，只有64个基因在蛋白水平上有明显变化。差异表达的蛋白有294个，其中214个在转录水平上没有显著差异，推测这些蛋白很可能存在转录后修饰。
文章亮点：
文章利用多组学（转录组学、蛋白组学、代谢组学）技术联合分析玉米受植食昆虫攻击后的响应机制，并构建绘制了系统的调控模型。这些数据对玉米防御昆虫灾害的进一步遗传学研究搭建了很好的框架，也为抗昆虫灾害的玉米新品种的培育奠定了良好的基础。

4.转录组数据构建蛋白库

广大人民群众喜闻乐见的饺子馅料，比如韭菜、茴香和大白菜等，至今还基本没有进行蛋白组研究。作为百合科植物，韭菜的基因组较大，至今都没有其基因组信息发表出来，公共数据库中的信息也很少，所以关于韭菜的基因检测研究一直都是个空白。
类似韭菜这种研究结果比较少的物种，可以采用转录组+蛋白组的测序方式，用转录组数据构建蛋白组数据库，后期进行蛋白的定性及定量，对蛋白鉴定数量的提升也有很大助力。

参考文献
[1]Wang Z, Peng S, Li Q, et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs[J]. Sci Rep, 2017, 7:46717.
[2]Alvarez S, Choudhury S R, Pandey S. Comparative Quantitative Proteomics Analysis of the ABA Response of Roots of Drought-Sensitive and Drought-Tolerant Wheat Varieties Identifies Proteomic Signatures of Drought Adaptability[J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(3):1688-701.
[3]Qi J, Sun G, Wang L, et al. Oral secretions from Mythimna separata insects specifically induce defense responses in maize as revealed by high-dimensional biological data[J]. Plant, 2016, 39(8):1749.

转录调控事业部 小 张丨文案
吴戈宇 | 审核
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