Bulked Segregant Analysis（BSA）分析是利用极端性状个体混池快速进行功能基因挖掘的常用方法，广泛应用在植物基因克隆方面。SLAF-seq是百迈客自主研发的简化基因组测序技术，通过对基因组特定的酶切片段进行高通量测序，在降低基因组复杂度的基础上，又获得大量的基因组变异信息，在群体遗传研究中发挥着重要作用。将SLAF-seq和BSA分析完美结合（SLAF-BSA）进行功能基因定位，是一种快速、准确、性价比极高的分析策略。日前，由百迈客和扬州大学陈学好教授课题组合作，利用SLAF-BSA策略定位黄瓜耐淹基因，相关研究成果发表于新一期的Plant Journal杂志。本期图谱君将对这一成果解读，同时文末继续有基于遗传群体进行基因定位的国自然标书，期待能给大家3月份的国自然基金申请带来一些灵感。
英文标题：The major-effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA-ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation
中文标题：CsARN6.1编码的AAA-ATPase基因通过促进不定根形成增强黄瓜耐水淹性
发表期刊：the Plant Journal， 2018
影响因子：5.90
背景
高等植物需要一定量的氧气来保持代谢和生长，然而在水淹状态下，土壤中氧含量比正常情况下低320,000倍，植物根系可利用氧气含量降低，进而影响植物根系的很多生长和代谢生理过程。水淹情况下，大量有害物质积累也会造成对植物的毒害作用。以上变化将严重影响植物生长、干物质积累以及植物最终的产量。所以，分离植物耐水淹基因、揭示耐水淹分子机制、开展耐水淹品种选育具有重要意义。
黄瓜是重要的蔬菜品种，其根生长浅，对氧气需求较为严格，这造成它对水淹胁迫非常敏感。在水淹胁迫下，黄瓜下胚轴通过产生不定根来获取氧气，以适应水淹胁迫。为解析水淹胁迫下黄瓜不定根生产现象的遗传学机制，研究者曾利用耐水淹材料Zaoer-N 和不耐水淹材料Pepino构建的群体进行QTL定位，已经分离了一个控制不定根数目的主效QTL ARN6.1，该QTL在多年的实验均解释了较高的表型贡献率。本研究将对该QTL进行精细定位，确定引起性状差异的基因，并进行多方面的验证。
材料方法
主要结果
1.不定根数目是数量性状且与水淹胁迫耐受力显著相关
表型观察发现，水淹处理7天后，Zaoer-N幼苗下胚轴生长出许多不定根，而Pepino几乎没有（图1）；通过对F2群体表型统计，所有子代的不定根数目表现出正态分布，这也说明了该性状为数量性状（图2）。另外，对F2群体的949个个体进行水淹耐受力评估打分，发现不定根数目与水淹耐受力之间呈显著正相关，皮尔森相关系数为0.72（P = 0.05），这表明不定根数目可以作为衡量水淹耐受力的可靠指标。
图1 Zaoer-N和Pepino不定根生长情况
图2 F2群体不定根数目分布统计
2、ARN6.1的初定位
利用SLAF-seq的方法对亲本及两个极端混池进行测序，亲本测序深度分别为29.18×和22.85×，两个混池的深度分别为50.6×和53.72×，以9930为参考基因组，利用△SNP-index和ED的方法计算显著关联位点，将关联区域定位在6号染色体标记SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096之间，区间大小301kb（图3）。
图3 BSA定位结果
3、ARN6.1的精细定位
利用定位区间侧翼SLAF标记（SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096）上的SNP，分别各开发KASP标记（KASP1和KASP13），并对2274个F2子代进行分型，获得33个重组个体；再在KASP1和KASP13之间开发11个KASP标记，对33个重组个体进行基因分型，共得到8种单倍型。结合重组个体基因分型和表型数据，将ARN6.1定位到61.5kb的区间（KASP10和KASP11）（图4a）。为进一步缩小区间，利用KASP10和KASP11对4417个F2个体进行分型，得到6个重组个体，这6个重组个体分别自交得到6个F2:3家系，然后利用新开发的5个dCAPS对F2:3家系进行分型，结合所有表型数据，最终将ARN6.1定位在36.1kb的范围内（图4b）。对该区进行注释，共有7个基因（图4c），有趣的是，其中5个基因都被预测为编码AAA 型的ATP酶家族蛋白。
图4 ARN6.1精细定位过程
2个亲本重测序分析，在36.1kb的区间内开发到25个SNP，为确定哪个SNP与性状真实相关，研究者对100个黄瓜自交系的23个SNP（2个SNP只存在于Zaoer-N中而被过滤掉）进行分型，结合每个自交系不定根数目的表型数据进行局部关联分析，结果显示SNP02与表型有较强的关联性。对SNP02分析发现，其位于Csa6G504460的第二外显子，可能就是引起变异的SNP位点（图5a）。
图5 Csa6G504460的分离及表达量分析
4、表达分析验证Csa6G504460
前期研究中，研究者对亲本Zaoer-N和Pepino幼苗下胚轴在水淹处理后进行转录组分析，以上定位区间内的7个基因只有Csa6G504460在处理组和对照组间存在差异表达，并且差异表达只发生在Zaoer-N中（图5b）。而后，研究者对这7个基因又进行qRT-PCR分析，同样发现只有Csa6G504460在Zaoer-N的处理组和对照组间存在差异表达，并且在处理后36h表达量差异出现峰值（图5c）。另外，组织特异表达分析表明Csa6G504460在多个组织中均有表达，但是在根中的表达量显著高于其他组织。因此，从基因表达角度验证了Csa6G504460（以下命名为CsARN6.1）的真实性。
5、CsARN6.1突变体降低ATP酶活性
基因组和cDNA序列分析显示，CsARN6.1拥有2个外显子，被预测为编码含有511个氨基酸残基的AAA-ATPase结构域蛋白，该蛋白中含有一个coiled-coil结构域（图6），前期关联到的SNP02即位于该结构域，由于该SNP的突变导致Asp被替换成Gly，Zaoer-N为CsARN6.1^Asp型，表现出较强的ATP酶活性，而Pepino为CsARN6.1^Gly型，几乎没有ATP活性（图7）。
图6 AAA-ATPase基因结构
图7 CsARN6.1^Asp和CsARN6.1^Gly蛋白活性比较
6、转基因验证
为验证CsARN6.1的功能，将CsARN6.1^Asp转入拟南芥中，发现转基因植株的根长显著长于对照，同时，转基因植株上可以明显观察到侧根发育，而对照组则没有侧根发育（图8）。为进一步验证，研究者将CsARN6.1^Asp转入黄瓜品种Xintaimici（CsARN6.1^Gly型），并经多代自交和筛选，获得单拷贝的纯合转基因植株。发芽后3天，转基因植株的初生根长度显著长于野生型。水淹处理后，转基因黄瓜下胚轴中CsARN6.1的表达量显著高于野生型。处理后7天，转基因黄瓜下胚轴的不定根数目明显高于野生型（图9 e.f.g.h）。另外，野生型黄瓜叶片和子叶的萎黄病较转基因黄瓜严重。以上转基因结果证实CsARN6.1能够促进不定根形成和黄瓜水淹耐受力（图9 i.j）。
图8 转基因拟南芥与野生型表型比较
图9 转基因黄瓜与野生型表型比较
7、ATP酶活性影响黄瓜不定根形成
前期研究发现，EDTA能够抑制AAA-ATPase蛋白的ATP酶活性。研究者通过体外实验发现，经EDTA处理的CsARN6.1^Asp蛋白的ATP酶活性相对于对照降低24%（图10 a）。随后，研究者用加入EDTA的水处Zaoer-N幼苗，以检测ATP酶活性损耗对下胚轴不定根的影响。结果发现，经EDTA处理后，Zaoer-N没有了不定根生成能力（图10 b.c）。
进化树分析显示，CsARN6.1与拟南芥At2G18190和At3G50930存在较高的同源性（图10d），而在之前研究中发现，H2O2处理拟南芥后，At2G18190.1和At3G50930.1被显著诱导表达。水淹后植物体内H2O2积累是普遍的生理响应。因而研究者尝试在水中加入H2O2后处理Zaoer-N幼苗，与无水处理的对照相比，48h后处理组植株CsARN6.1的表达量是对照组的4.3倍，与不加H2O2的水处理的对照相比，48h后CsARN6.1的表达量是对照组的2.1倍（图10 e）。5天后统计不同处理的材料下胚轴不定根数目，发现与不加H2O2的水处理的对照相比，水中加入H2O2的处理组的不定根数目增加60%（图10 f.g）。
图10 EDTA及H2O2处理对ATP酶和黄瓜生根的影响
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