集群分离分析方法( bulk segregant analysis ,BSA)是快速有效地寻找与目的基因紧密连锁分子标记的经典方法,广泛应用于作物育种。将简化基因组测序SLAF-seq与传统BSA相结合的SLAF-BSA,能更快速、准确、精细定位目标性状,具有混池规模大、标记密度高、数字化定量统计基因型频率等诸多优点。
应用领域
1. 功能基因定位;
2.分子标记辅助育种(MAS)。
选材要求
1. 有参考或无参考基因组序列的物种(二倍体、四倍体、六倍体物种均可);
2. 具有重要农艺性状个体构建的遗传群体(临时群体:F1、F2;永久群体:RIL、DH、NIL 等);
3. 混池规模:质量性状-不低于50+50(混池越大,越有利于消除背景噪音);数量性状-推荐选取群体规模的5%-10%来构建混池,同时不低于50+50。
测序方案
1. Hiseq2500平台,PE125;
2. 推荐混池中每个子代标签平均深度≥1×,亲本标签平均深度≥20× 。
分析内容
1. 测序数据质控;
2. SLAF标记开发(SNP、InDel);
3. 关联分析;
4. 候选区域SNP及基因功能注释(GO、COG、KEGG、NR、SwissProt注释)(针对有参考基因组物种)。
项目周期:40天

1.混池规模大:DNA混池可达200+200,甚至更高;
2.服务个性化:根据不同物种、不同科研需求,个性化设计标记开发方案;
3.项目经验丰富:百迈客成功完成了近300个物种的1000多个性状的定位工作;
4.性价比高:与人工筛选数百标记的总费用相当,却无需您投入大量的人力和时间。

1. 样品类型:基因组DNA;
2. 样品浓度:≥20 ng/ul;
3. 样品总量:单个混池DNA≥2ug,体积≥20ul;单个子代DNA≥1ug,体积≥10ul;亲本DNA≥2ug,体积≥20ul;
            组织样品≥1g;
4. 样品纯度:OD260/280为1.7~2.2;
5. 电泳要求:主带清晰,无降解或轻度降解(距送样日最近的电泳结果)。

样品保存与运输
1. 基因组DNA样品请仔细纯化,尽量避免污染,并请将所送样品保留备份;DNA样品置于1.5 ml无菌离心管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口;
2. 植物组织样品请尽量选用幼嫩新鲜的,取样后用锡箔纸包裹并标注,立即放入液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中。动物组织、细胞或菌体取样后置于冻存管中并标注,立即放入液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中。请尽量使用新制备的样品;
3. 请将所有样品集中置于管、盒或袋中,以免散装导致样品的丢失。在运输过程中,最好放在干冰中,时间不要超过72小时,如果利用冰袋运输,则时间最好不要超过24小时,尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。如果条件许可,可在邮寄的箱子上下添加部分棉花,以保证尽量隔绝热量的传递。

《Scientific Reports》:SLAF-BSA解析黄瓜果肉厚度


实验设计
采用SLAF-seq技术对黄瓜果肉厚的品种D8和果肉薄的品种XUE1,以及D8和XUE1杂交构建的F2子代进行上机测序,其中子代极端性状混池规模为50+50,定位黄瓜厚果肉基因。
结果展示
1.SLAF-BSA定位结果:将控制黄瓜果肉厚度基因定位在2号染色体0.19M的区域,该区域包含23个SLAF标签。
2. SSR遗传图谱QTL定位结果:开发143个SSR标记,在以D8和XUE1杂交构建F2群体上构建连锁图谱,上图标记100个,通过图谱QTL将果肉厚度定位在2号染色体约17cM的区域,该结果与SLAF-BSA一致。
3. 候选基因的验证:qRT-PCR对上述候选区域内的20个基因进行验证,得到一个存在遗传突变的候选基因。

 

参考文献
Xu X, Lu L, Zhu B, et al. QTL mapping of cucumber fruit flesh thickness by SLAF-seq[J]. Scientific reports, 2015, 5.

 

《Plos One》:SLAF-BSA定位油菜千粒重候选基因


实验设计
采用SLAF-seq技术对油菜粒大品种G-42和粒小品种7-9,以及G-42和7-9杂交构建的DH子代进行上机测序,其中子代极端性状混池规模为46+47,定位控制千粒重的候选基因。
结果展示
1.SLAF-BSA定位结果:采用SNP-index和ED两种关联分析方法对千粒重进行定位,定位结果相同,共4个SLAF标签与千粒重相关,分布在9号染色体0.58M的区域,区域内共91个基因。
2. 功能注释:对候选区域内的91个基因进行GO、COG、NR、KEGG、Swiss-Prot注释,共注释到90个基因,发现4个与千粒重相关的候选基因,分别是:GSBRNA2T00037136001,GSBRNA2T00037157001,GSBRNA2T00037129001 和 GSBRNA2T00069389001。

 

参考文献
Geng X, Jiang C, Yang J, et al. Rapid Identification of Candidate Genes for Seed Weight Using the SLAF-Seq Method in Brassica napus[J]. PloS one, 2016, 11(1).

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