一代测序菌种鉴定

一代测序技术诞生于 1977 年，其核心方法是弗雷德里克・桑格发明的双脱氧链终止法，又称桑格法测序，是一种基于DNA复制原理的高精度测序技术，广泛应用于基因组学研究。由于其通量低，一次测序只能处理有限数量的片段，实验流程复杂、成本较高，应用场景有限，因此更适合于小片段少量样品。基于此，百迈客结合一代测序的特点，更倾向于该技术应用到功能基因（含核糖体）或pCR产物的小规模测序。

一代测序的特点

1.高准确性：一代测序的准确性可达99.999%，适合用于验证基因组组装的完整性；

2.长读长：测序读长可达1000bp，适合于较长的DNA片段测序；

3.低通量：与二代测序相比，一代测序的通量较低，成本较高，限制了其在大规模基因组测序的应用。

一代测序技术主要采用双脱氧链终止法（Sanger法），其核心在于使用双脱氧核苷酸（ddNTP）来中止DNA链的延伸。具体步骤如下：

1、DNA 提取

细菌：细菌基因组 DNA 提取试剂盒

真菌：真菌基因组 DNA 提取试剂盒

2、PCR 扩增

用菌种鉴定通用或定制化引物进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物条带是否与目的大小相符，是否单一，有无拖带。

3、PCR 产物测序

PCR 产物检测合格后，切割目的条带进行纯化回收，用回收后的产物在 ABI 公司的 3730XL 测序平台上进行 Sanger 测序。

4、测序结果比对分析

• Sanger 测序结果用软件 CAP3 进行质控拼接，得到每个样本的 contig 序列；
• 使用 BLAST 将 contig 序列比对到 NT 数据库，获得物种信息；每个 contig 序列选取 E value最小的前 10 个比对物种，结果在 03.blast 文件夹中的 all_contigs.nt_blast.xls 文件；选取 Evalue 最小的物种作为本次菌种鉴定的结果物种（如果 E value 相同，进一步按照 score 值进行排序，选择 score 值最大的物种）。