葡萄叶际泛宏基因组蓝图，微生物组防治葡萄霜霉病
研究背景
葡萄是世界上最重要的经济水果作物之一，微生物组深刻影响其健康、产量和品质。然而，对微生物组调控葡萄生物学的机制理解仍然有限。
该研究首次基于107个葡萄种质的大规模叶际样本，整合宏基因组、转录组与表型组分析，系统解析了葡萄叶际核心微生物组以厚壁菌门和假单胞菌门为主导的结构特征，并利用PacBio长读长测序成功组装出19个高质量的植物相关宏基因组组装基因组，首次实现了从植物PacBio数据中重建微生物基因组。研究发现抗霜霉病葡萄的微生物网络复杂度显著高于感病植株，其中厚壁菌门与眼虫门、蓝藻门等关键类群的正向互作与抗病性密切相关；研究进一步通过微生物分离培养与接种试验，验证了叶际关键菌株——蜡样芽孢杆菌对霜霉病的显著生物防治效果。该工作不仅揭示了葡萄叶际微生物组通过调控网络复杂性和真核微生物代谢以增强寄主抗病的机制，也为基于微生物组工程的葡萄病害绿色防控策略提供了重要的基因组资源与理论支撑。
方案设计
取材样本广度：跨物种、跨表型的大样本量覆盖
物种与品种维度：选取 34 个葡萄属（Vitis）物种的 107 个葡萄藤材料，包含 100 个不同栽培品种，覆盖不同遗传背景，确保微生物组分析的 “泛基因组” 代表性，避免单一品种的局限性。
关键表型维度：明确区分 “霜霉病抗性” 与 “易感” 表型，为后续对比分析微生物组与抗病性的关联提供直接依据。
地理与环境维度：样本来自中国山东潍坊、河南郑州两个不同产区的葡萄园，且参考全球葡萄叶面微生物组数据进行验证，确保结果的地域普适性，排除局部环境的偶然影响
样本类型：匹配多组学技术的针对性取材
DNA 样本：同时提取适用于 Illumina 短读长测序（微生物群落组成分析）和 PacBio 长读长测序（宏基因组组装基因组 MAGs）的核酸样本，短读长保证群落覆盖度，长读长提升基因组组装质量。
RNA 样本：采集霜霉病接种后 1 天（感染初期）和未接种的叶片样本，针对性捕获微生物组在病害胁迫下的转录组变化，关联 “功能表达” 与 “抗病响应”。
验证样本：从抗性葡萄叶片中分离微生物菌株（如蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus），用于后续生物防治活性验证，实现 “组学发现 — 实验验证” 的闭环。
研究结果
1、葡萄核心微生物组由厚壁菌门和假单胞菌门主导
为了研究不同葡萄叶际微生物组的谱系，收集来自34个葡萄属物种的共107个叶片样本，涵盖100个具有不同基因型和霜霉病抗性的葡萄品种，其地理来源各异
使用Kraken2对这些微生物读长进行物种分类，在葡萄叶际共鉴定出1,326个属（图a）。其中，在门水平上，厚壁菌门（43.6%）和假单胞菌门（37.9%）主导了微生物组谱，而植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus）（42.1%）和黄单胞菌属（Xanthomonas）（22.2%）是两个最丰富的属（图b）。此外，界水平分析表明细菌主导了葡萄叶际微生物组（91.3%），其他界占比不到10%（图c）。值得注意的是，非细菌界也显示出主导门，例如古菌界由广古菌门（Euryarchaeota）主导，真核生物界由子囊菌门（Ascomycota）和眼虫门主导，病毒界由Cressdnaviricota门主导，反映了葡萄微生物组在门水平上的特异性优势。为了检验我们微生物组成的全球代表性，我们使用相同的生物信息学流程分析了已发表的包含全球葡萄叶际收集的Illumina数据中的全球代表性种质。全球微生物组的门水平微生物组成与我们的基于Illumina的组成基本一致，证明了微生物组成的全球代表性。这些结果突出了厚壁菌门和假单胞菌门的普遍存在及其在葡萄微生物组中的潜在作用。
2、葡萄叶际宏基因组组装基因组的组装
总共生成了19个非冗余的GPMAGs（图a），这些MAGs基于标准MAG质量评估标准达到了中等质量阈值。其中，四个被分类为完整，三个为接近完整，五个为高质量，七个为中等质量MAGs（图b），突出了GPMAGs的高质量。GPMAGs的中位基因组大小为：完整MAGs 4.5 Mb，接近完整MAGs 4.6 Mb，高质量MAGs 4.7 Mb，中等质量MAGs 4.2 Mb（图c），接近典型的细菌基因组大小。随后，使用GTDB-tk对GPMAGs进行微生物谱鉴定。在已分类的GPMAGs中，63.2%属于假单胞菌门，5.3%属于厚壁菌门，21.1%属于放线菌门（图d），除厚壁菌门外，与基于Illumina的微生物组成基本一致。为了研究不同PacBio种质间GPMAGs的泛基因组谱，我们进一步通过PacBio读长对每个GPMAGs的比对率来考察GPMAGs在不同葡萄种质中的普遍性。在所有葡萄种质中，Mangrovibacter phragmitis 表现出最高的普遍性，其次是Roseateles 和 Sphingomonas aquatilis（图e）。有趣的是，这些GPMAGs都属于假单胞菌门，进一步支持了基于Illumina的微生物组成所显示的该门在葡萄种质中的普遍性。此外，所有代表最高MAG质量（完整和接近完整）的GPMAGs也属于假单胞菌门，强调了MAG质量与普遍性之间的强关联。
总之，这些结果突出了基于PacBio的高质量和全面组装的GPMAGs，它们是研究葡萄叶际微生物组的宝贵基因组资源。
3、葡萄MAGs的注释揭示了编码关键生物过程的基因
对GPMAGs进行了基因组注释，GPMAGs中的功能多样性高度集中，核心生物功能相关，如转录、代谢和运输，暗示了对葡萄叶际生态位的专门适应。尽管次级代谢产物的生物合成和不同环境中的微生物代谢是主要的生物通路术语，top20仅占总注释的47.9%，显示出GPMAGs的功能多样性。这些结果表明GPMAGs既具有功能一致性，又具有广阔的代谢潜力，可能促进了在葡萄叶际的定植和适应。
来自GPMAGs的注释CDSs频繁编码与抗生素抗性相关的蛋白质，如ABC转运蛋白，表明AMR基因在GPMAGs中广泛存在。具体来说，我们使用RGI鉴定了93个AMR基因，涵盖16个不同的AMR家族。值得注意的是，很大一部分AMR基因通过抗生素外排表现出多药耐药性，这是一种主要的耐药机制。葡萄微生物组中丰富的AMR基因存在表明，抗生素耐药性可能是由于葡萄栽培中长期施用和误用农药所致。
为了探索葡萄微生物组中多糖生产的潜力，使用dbCAN对GPMAGs中的CAZyme基因进行了注释。分析共鉴定出1,144个CAZyme基因，涵盖143个独特的酶家族，反映了葡萄叶际微生物组强大的多糖代谢能力。在这些基因中，糖基转移酶（GTs）和糖苷水解酶（GHs）尤其丰富，GT2、GT4、GT51和GH13成为最普遍的家族，表明其重点集中在多糖的合成和修饰上。此外，多种碳水化合物结合模块（CBMs）和辅助活性（AAs）的存在突出了微生物组的多样性及其参与植物-微生物相互作用的潜力。这种广泛的CAZyme库表明，葡萄叶际微生物组可能通过多糖合成和其他与寄主相互作用的机制影响各种寄主生理过程，包括抗病性和生长。
4、霜霉病抗性与微生物相互作用网络的复杂性及关键属的存在相关
尽管抗病与感病葡萄品种的微生物组在组成上差异不大，但通过SpiecEasi网络分析发现，抗病品种的微生物互作网络显著更复杂，尤其是负相关（拮抗）互作数量更多，提示微生物间的抑制关系可能在抗病机制中发挥关键作用。进一步分析发现，抗病品种中某些核心属如Liberibacter、Pseudomonas和Bacillus在网络中处于关键节点，具有更高的丰度和互作频次。其中，Bacillus cereus的两个菌株在实验中表现出对霜霉病原菌Plasmopara viticola的显著抑制作用，即使在低浓度下也能有效降低病斑扩展。这一结果不仅验证了关键菌属的功能潜力，也为开发微生物源生防制剂提供了候选菌株。
5、霜霉病感染激活葡萄叶片真核微生物的代谢响应
为探究微生物组在病原胁迫下的功能变化，研究人员对感染与未感染的葡萄叶片进行了RNA测序，并聚焦于非葡萄、非病原的真核微生物转录本。结果显示，感染后共有40,546个转录本显著上调，5,081个下调，表明微生物组整体转录活性显著增强。功能富集分析显示，这些上调基因主要参与初级代谢（如TCA循环、糖酵解）和次级代谢（如抗生素、聚酮类合成）通路。特别是，次级代谢相关基因集在GSEA分析中显著富集，包含多个与抗生素合成相关的酶类，如酮酰还原酶（KR）和黄素依赖脱氢酶。这些结果提示，葡萄叶片真核微生物在病原侵染时可通过激活代谢防御机制，参与竞争性排斥和抑菌物质合成，从而增强植物抗病性。
结论
本研究对来自34个葡萄属物种的107个葡萄种质的叶际微生物组进行了大规模的泛宏基因组和泛宏转录组分析。我们发现葡萄核心微生物组主要由厚壁菌门（Bacillota）和假单胞菌门（Pseudomonadota）主导。利用PacBio测序，我们从葡萄泛微生物组中组装了19个高质量的宏基因组组装基因组（MAG），这是首次使用PacBio读长在植物相关微生物群落中重建MAG。这些MAG编码与抗生素抗性、次级代谢和碳水化合物活性酶（CAZymes）相关的基因，这可能潜在地影响葡萄生物学。
在霜霉病感染期间，抗霜霉病葡萄的微生物网络复杂性显著高于感病葡萄。在促成这种复杂性的关键类群中，厚壁菌门成为主导门，与眼虫门（Euglenozoa）和蓝藻门（Cyanobacteria）显示出强烈的丰度相关性，并且从葡萄叶片中分离出的一种厚壁菌——蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）显示出对霜霉病感染有效的生物防治活性。泛转录组分析进一步揭示了参与初级和次级代谢的真核微生物基因显著上调。
