Spatial ATAC 操作指南
环境配置
1. conda安装
wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64.sh
下载完成之后运行（按提示安装）
sh Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64.sh
安装完成后执行以下命令
source ~/.bashrc
2. 环境配置
conda create -n (环境名) python=3.9
激活环境：
conda activate (环境名)
添加镜像源
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/main/
查看镜像源
conda config –show channels
3. 安装python模块
conda install numpy=1.23.4
conda install opencv=4.7.0
conda install pandas=2.2.2
conda install matplotlib=3.8.4
conda install tqdm=4.66.4
conda install seaborn=0.12.2
conda install tifffile
conda install scanpy=1.9.8
4. 软件安装
conda install samtools=1.18 sambamba=1.0.1 bedtools=2.31.1
conda install macs2=2.2.7.1
conda install deeptools=3.5.5
conda install ucsc-bedgraphtobigwig=472
conda install bwa=0.7.17
conda install bioconda::cutadapt=5.0
conda install bioconda::ucsc-bedsort
conda install bioconda::ucsc-bedclip
5. 安装指定R版本（v4.3）
conda install -c conda-forge r-base=4.3.1
6. 安装指定R包
conda install -c conda-forge r-signac=1.14.0
conda install -c conda-forge r-seurat=4.3.0
conda install bioconda::bioconductor-rtracklayer=1.62.0
conda install -c conda-forge r-kableextra=1.4.0
conda install -c conda-forge r-optparse=1.7.5
conda install -c conda-forge r-this.path=2.7.0
conda install conda-forge::r-r.utils
conda install conda-forge::r-devtools=2.4.5
options(timeout = 9999999999999)
devtools::install_github(“davidsjoberg/ggsankey”)
install.packages(‘DT’)
参考基因组配置
参考基因组需要使用bwa进行建库（流程使用bwa比对）
gtf文件中需包含gene_id，gene_name，gene_biotype/gene_type
人和小鼠基因组推荐使用：
https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger-arc/latest/release-notes/reference-release-notes
refdata-cellranger-arc-GRCh38-2020-A-2.0.0
refdata-cellranger-arc-mm10-2020-A-2.0.0
其他基因组可自行选择版本。
配置文件填写
配置文件可参考config.txt进行填写，内容说明如下：
## fq数据路径，FQ1为read1文件路径，FQ2为read2文件路径
FQ1 /path/to/read_1.fq.gz
FQ2 /path/to/read_2.fq.gz
## 芯片解码文件路径
FLU /path/to/flu_info.txt
## 组织明场图片路径
HE /path/to/HE.tif
#INSIDE 1 #是否扣除组织内部空白区域，默认1扣除，选0为保留
## 组织荧光图片路径
#FL /path/to/FL.tif #组织荧光图，和HE图二选一
#FLC -1 #荧光图颜色通道，值为0，1或2，选择-1为自动判断
## 组织区域文件路径
JSON /path/to/roi.json #如不给定，则流程会自动使用上面的图片进行识别，自动识别建议使用荧光图
## 参考基因组文件
GenomeVer xxxx #版本信息，出现在报告中
Ref /path/to/ref/genome.fa #基因组fa文件
Gtf /path/to/ref/gene.gtf #基因组gtf文件
SPECIES human #物种文件，人和小鼠分别为human/mouse，其他物种自行给定
## 输出结果及输出文件前缀
OUTDIR /path/to/result/dir/
PREFIX outfile-prefix
## barcode 类型，S3000芯片无特殊情况为V2
BCType V2
## 线程数
Threads 8
## cs序列类型，无特殊情况为cs12
CSType cs12
软件运行
在配置好的环境中，运行命令：
/path/to/BSATAC -c config.txt -s 0
其中 -c 是配置文件，-s 是所选择运行的步骤，0是全部运行
结果说明
outdir/
├── 01.fastq2BcUmi # barcode识别目录
├── 02.LinkBcChip # 芯片barcode对应
├── 03.AllheStat # 多级分辨率和组织区域处理
├── 04.Cutadapt # 接头过滤
├── 05.Mapping # reads比对结果
├── 06.Fragment # Fragment分析
├── 07.WebReport # 网页版报告
├── BSTViewer_project # 收集的结果目录
└── prefix # 芯片原始barcode结果
联合分析操作指南
注意说明，当前分析需要百创智造的空间RNA和空间ATAC分析流程输出的结果！！！
空间RNA和空间ATAC的主要结果各自存储在BSTViewer_project文件下。
1. FiJi对齐
1.1:百创智造空间ATAC与空间转录组联合分析之切片对齐概述
https://zhuanlan.zhihu.com/p/1903040885328945604
1.2:百创智造空间ATAC与空间转录组联合分析之切片对齐前图像生成-01
https://zhuanlan.zhihu.com/p/1898370805919903880
1.3:百创智造空间ATAC与空间转录组联合分析之FIJI中手动对齐切片-02
https://zhuanlan.zhihu.com/p/1903079101796941928
1.4:百创智造空间ATAC与空间转录组联合分析之切片上点的映射-03
https://zhuanlan.zhihu.com/p/1903081341429452952
1.5:百创智造空间ATAC与空间转录组联合分析之Level1向其他level水平的点映射-04
https://zhuanlan.zhihu.com/p/1907854262597321846
其它: Fiji的下载与安装（windows 10）
https://zhuanlan.zhihu.com/p/18027378723
特殊说明：软文详细讲解了对齐的原理，脚本实现以及结果说明。其中，软文中涉及的脚本存在 [SpatialATAC/v1.0.2/fragment/ImageJ_FJ] 中。
2. 联合分析
2.1 配置文件说明
配置文件可参考config.yaml [SpatialATAC/v*/fragment/Joint_analysis/v*/] 进行填写，内容说明如下：
ATAC和RNA分析路径(一级目录下)
ATAC_analysis path/BSTViewer_project/
RNA_analysis path/BSTViewer_project/
######映射文件(通过Image Fiji获取)(默认读取L18 L9 L7 L5四个水平的结果)Fiji path/
输出路径 outdir path/analysis
##其它参数 alpha 0.1 ##透明度,范围是0-1 logfc 0.1
2.2 流程执行
perl Joint_main_v1.2.pl -c config.yaml -s 0
其中 -a -b -c 是配置文件，-s 是所选择运行的步骤，0是全部运行
perl Joint_main_v1.2.pl
Usage:
-a spatial config ##空间转录组主流程的配置文件
-b atac config ##空间ATAC主流程的配置文件
-c joint config ##联合分析的配置文件（见2.1）
-s run step
step number:
0: run all step
1: Joint analysis
2: Joint report
3: total report
2.3 结果说明
L*_alignment/
├── L*_Joint_marker_gene.csv ##联合分析marker基因
├── L*_joint.rds ##rds文件
├── L*_Sankey_plots.pdf ##桑基图
├── L*_Sankey_plots.png
├── L*_heatmap.pdf ##marker基因热图
├── L*_heatmap.png
├── L*_CoveragePlot.pdf ##基因组浏览器图
├── L*_CoveragePlot.png
├── L*_Spatial_ATAC.cluster.pdf ##ATAC聚类图
├── L*_Spatial_ATAC.cluster.png
├── L*_Spatial_Joint.cluster.pdf ##联合分析聚类图
├── L*_Spatial_Joint.cluster.png
├── L*_Spatial_RNA.cluster.pdf ##RNA聚类图
└── L*_Spatial_RNA.cluster.png
**特殊说明**
1. L*_joint.rds 中存在3个assay,分别是：ATAC(peak矩阵)，Spatial（表达矩阵），RNA（活性矩阵）。
2. 结果生成2个报告：联合分析的报告，以及Spatial、ATAC以及联合分析的汇总报告
