众所周知，外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等；同时，外泌体与疾病诊断、预后等密切相关，因此也可以作为分子标志物；当然，外泌体经过一定修饰后，可作为载体将包裹在其内的药物/货物运送到特定靶标组织或区域。
下面我们来为大家分别介绍2篇近期发表的外泌体小RNA测序研究方法，一个方法是为机制机理研究方向，另一外泌体研究方法为分子标志物研究方向。
外泌体研究方法：【文献一】
该研究由南京大学医学院附属鼓楼医院的学者完成，题目：间充质基质细胞来源的外泌体通过miR-182调节巨噬细胞极化减弱心肌缺血再灌注损伤。
研究背景
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）逐渐成为调节心脏炎症的有力候选者，MSCs分泌的外泌体可能是心肌梗死后MSCs移植起作用的新机制。作者探讨了MSC来源外泌体（MSC-Exo）在心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）后巨噬细胞免疫调节中的作用及其在心脏损伤修复中的意义。
主要研究方法
使用梯度离心法从MSC的上清液中分离外泌体（MSC-Exo）；
在心肌缺血/再灌注（I/R）之前和之后24小时施用巨噬细胞清除剂-二氯亚甲基二膦酸盐(Cl2MDP)脂质体，再灌注后0h立即递送MSC-Exo或PBS在至心肌。检测梗塞面积以及心脏和血清中的炎症水平等；
流式细胞检测分析巨噬细胞M1和M2比例；
MSC-Exo miRNA测序分析鉴定巨噬细胞极化的有效候选分子和其靶基因。
研究结果
在心肌I/R后通过心肌内注射给小鼠施用MSC-Exo减少了梗塞面积并减轻了心脏和血清中的炎症水平；
用巨噬细胞清除剂-二氯亚甲基二膦酸盐(Cl2MDP)脂质体消除了MSC-Exo的疗效；
MSC-Exo在体内和体外均调节促炎的M1巨噬细胞向抗炎的M2巨噬细胞极化；
MSC-Exo-miRNA-seq揭示miR-182可能作为巨噬细胞极化的有效候选介质，以及其下游靶基因TLR4。敲低MSC-Exo中miR-182部分减弱其对巨噬细胞极化的调节，TLR4的敲低也赋予心肌I/R小鼠模型中的心脏保护功效并降低炎症水平。
外泌体研究方法：【文献二】
该研究由中央民族大学生命与环境科学学院/转化神经科学研究中心负责人程勇教授领导课题组完成，题目：全基因组整合分析提示精神分裂症外泌体来源的miRNA失调。
研究背景
精神分裂症（schizophrenia，SCZ）风险相关的遗传变异已经被广泛研究了，但是SCZ相关的转录后机制尚未得到很好的研究。并且这些遗传变异通常是微效的。除遗传因素外，越来越多的证据表明表观遗传学可能参与SCZ的发病机制。已知的表观遗传标记中，microRNAs（miRNAs）在过去十年中备受关注，已被证明在神经发育和中枢神经系统的维持中发挥关键作用，例如神经分化、突触可塑性和认知功能。以往的研究提示miRNA可作为各种神经精神疾病的潜在生物标志物。
方法和结果
1、miRNA筛选：
血清exo-miRNA-seq，49个第一次发作未用药的SCZ患者 vs 46个HC对照；
1）training set：23个SCZ患者 vs 23个HC对照，鉴定高表达（TPM≥10）的、显著差异表达（FDR<0.05）且差异倍数较高(FC≥2)DEmiRNAs：hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p和hsa-miR-133a-3p。
2）testing set：26个SCZ患者 vs 23个HC对照，鉴定高表达（TPM≥10）的、显著差异表达（FDR<0.05）且差异倍数较高(FC≥2)DEmiRNAs共计7个，包括前面training set的3个DE miRNA。
3）pooled set：综合上述2个set，共计6个miRNA符合上述条件：6 miRNAs (hsa-miR-206、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-184)。
2、随机森林分类器鉴定SCZ诊断分子标志物：
使用training set鉴定到一组11个miRNA，其AUC（Area Under Curve）为0.94 (95% CI, 0.88–1.0)，敏感性0.783，特异性0.957。
testing set中验证该组11个miRNA的敏感性为0.769，特异性为0.783，AUC 为0.753 (95% CI,0.61–0.90）。
3、SCZ外泌体miRNA共表达模块分析：
上述pooled set（49个SCZ患者 vs 46个HC对照）进行miRNA WGCNA分析，共计鉴定到11个共表达的模块，其中3个与疾病状态显著相关。
4、DE miRNA以及SCZ相关miRNA共表达模块靶基因通路和功能富集分析：
比如hsa-miR-206，其是SCZ患者的血液外泌体中最显著上调的miRNA，并且之前报道其调节脑源性神经营养因子BDNF表达。显著相关miRNA共表达模块靶基因显著富集到了O型聚糖的生物合成等通路，GO富集到了神经递质转运蛋白、树突棘和树突发育相关term。
4、qRT-PCR验证DEmiRNA表达及其靶基因表达验证：
qRT-PCR验证：100个SCZ患者（57例第一次发作未用药患者FEDF和43例长期治疗患者CT）vs 100个对照对于hsa-miR-206、hsa-miR-144-3p其验证结果与二代测序一致，且经过长期治疗在CT组其水平会向正常组趋近。靶基因表达和elisa结果显示SCZ患者血液中BDNF mRNA和蛋白质水平降低。greenyellow模块中靶基因GALNT8和GALNT15也显著降低。
文献一：Zhao J, Li X, Hu J, et al. Mesenchymal Stromal Cell-Derived Exosomes Attenuate Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through miR-182-Regulated Macrophage Polarization[J]. Cardiovascular Research, 2019.
下载：链接: https://pan.baidu.com/s/1qficU6O8O-xpv8ZCrqMlnw 提取码: 2nrh
文献二：Du Y, Yu Y, Hu Y, et al. Genome-Wide, Integrative Analysis Implicates Exosome-Derived MicroRNA Dysregulation in Schizophrenia[J]. Schizophr Bull. 2019 Feb 16.
下载：链接: https://pan.baidu.com/s/1BIzQ76znwBRt_AemCaHC_A 提取码: b6jy
期望能给您的研究带来一些思路启发，如果您的科研项目问题，可以点击下方按钮咨询我们。
京公网安备 11011302003368号