宏基因组Binning分析

不同菌株分类鉴定的重要手段

产品简介

Binning 指将宏基因组测序得到的混合了不同微生物的序列 reads 或序列组装得到的 contigs 或 scaffolds 按物种分开归类的过程。这些分开归类的序列被称为宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes，MAGs）。宏基因组测的是一个环境中的全部微生物的基因组信息，以获得群落中全部的物种信息和功能信息，而 Binning 可以把宏基因组数据中来自同一菌株的序列聚到一起，得到一个菌株的基因组，对不同的菌株进行分类鉴定。Binning 分析使我们得以洞察这些无法在实验室培养获得的菌株的生态适应机制、营养互作机制和新陈代谢功能等，可以研究在环境中起重要作用的微生物、进化机制、及其与宿主的互作机制等。

产品优势

1

打破传统纯培养方法的局限，能够直接从环境样本中获取大量未培养微生物的基因信息，极大地拓展了微生物基因组资源的库容。

2

结合三代长读长测序技术，能够有效跨越重复序列和复杂基因结构，组装出质量更高、完整性更强的宏基因组，可从环境群落中直接恢复高质量的单菌基因组，甚至可达成图水平。

3

为菌群的分类和功能描述提供更多样化的解决方案；便于与其他组学进行联合分析，挖掘更深层次的生物学机制，显著提升研究深度，更容易产出高分文章。

Binning 分析流程

Binning 分析流程示意图

图 1  Binning 分析流程示意图

结果展示

GC-Depth 散点图

通过 GC-Depth 散点图可以看出测序时是否存在了明显的 GC 偏向，也可以判断是否存在污染等情况。一般情况下，相对于中等 GC 含量区域来说，高 GC 含量区域或者低 GC 含量区域的测序深度都比较低。

GC-Depth 散点图

图 2  GC-Depth 散点图

TNF-PCoA 图

通过计算 bin 中每条 contig 中每种四核苷酸组合出现的概率，得到四核苷酸频率（TNF）的结果，并基于此进行主坐标分析（PCoA）。

TNF-PCoA 图

图 3  TNF-PCoA 分析图

基因组组分分析

对高质量 Bin 去冗余后得到的结果进行 de novo 基因预测，分别得到编码基因、重复序列、tRNA 及 rRNA 基因信息。

表格 7  基因预测结果统计（部分结果展示）
Bin ID Gene number Total length (bp) Average (bp) Max length (bp) Min length (bp)
M8_bin51 3,466 2,779,929 802.0 8,016 60
表格 8  重复序列预测结果统计（部分结果展示）
Bin_replD Total repetitive sequence length (bp) Repetitive sequence content (%)
M8_bin51 2,430 0.08
表格 9  rRNA 预测结果统计（部分结果展示）
Bin ID rRNA type number Rfam_id
M8_bin51 5S_rRNA 1 5S_rRNA

注：Bin ID：bin 编号；rRNA type：核糖体 RNA 分类；number：不同类型的核糖体 RNA 数量；Rfam_id：不同类型的核糖体 RNA 种类。此外，若表格中显示为空，表示该基因组没有预测出 rRNA。

表格 10  rRNA 预测结果详情表（部分结果展示）
Bin_ID ContigID source type start end score strand attributes
M8_bin51 M8|ctg00014 Rfam rRNA 450 564 75.1 + ID=5S_rRNA_1;Rfam_family_id=5S_rRNA;Rfam_accu value=1.1e-11;trunc=no;model_start=1;model_context=0.60
表格 11  tRNA 预测结果统计表（部分结果展示）
Bin ID total Cys His Undet Ser Val Met Gln Pro Lys Thr Phe Ala Gly Asp Leu Arg fMet Trp
M8_bin51 36 2 1 1 3 1 1 2 2 2 3 1 1 2 1 5 3 1 1
表格 12  tRNA 预测 GFF 文件（部分结果展示）
Bin_ID ContigID source type start end score strand attributes
M8_bin51 M8|ctg00004 tRNAscan-SE tRNA 3,508 3,583 78.4 + ID=tRNA_0001; Type=Pre; Anti-codon=GAA;
M8_bin51 M8|ctg00005 tRNAscan-SE tRNA 2,710 1,795 79.5 + ID=tRNA_0002; Type=Thr; Anti-codon=GGT;
M8_bin51 M8|ctg00006 tRNAscan-SE tRNA 2,547 2,623 81.1 + ID=tRNA_0003; Type=Pro; Anti-codon=TGG;
M8_bin51 M8|ctg00006 tRNAscan-SE tRNA 5,779 5,855 75.1 + ID=tRNA_0004; Type=Arg; Anti-codon=TCT;
M8_bin51 M8|ctg00007 tRNAscan-SE tRNA 2,805 2,894 91.5 - ID=tRNA_0005; Type=Ser; Anti-codon=TGA;
M8_bin51 M8|ctg00007 tRNAscan-SE tRNA 1,142 1,226 76.3 - ID=tRNA_0006; Type=Tyr; Anti-codon=GTA;

功能注释分析

功能注释分析与常用数据库（NR、KEGG、eggNOG、CAZy、CARD）进行比对，获得基因功能信息并对各数据库注释情况进行统计。

KEGG 代谢通路相关功能基因在二级水平上的统计图

图 4  KEGG 代谢通路相关功能基因在二级水平上的统计图

eggNOG 功能基因功能分类统计图

图 5  eggNOG 功能基因功能分类统计图

碳水化合物酶分布比例图

图 6  碳水化合物酶分布比例图

抗生素抗性基因丰度统计图

图 7  抗生素抗性基因丰度统计图

物种鉴定

利用 GTDB-Tk 软件，根据基因组数据库 GTDB 为 bins 进行物种分类注释。

表格 20  bins 物种鉴定结果
Bin_ID Taxonomy
maxbin2_M1_bin1 d__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteobacteria; o__Burkholderiales; f__Burkholderiaceae; g__
concoct_M8_bin75 d__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteobacteria; o__Burkholderiales; f__Burkholderiaceae; g__
metabat2_M2_bin3 d__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Alphaproteobacteria; o__Rhizobiales; f__Rhizobiaceae; g__Mesorhizobium
concoct_M8_bin51 d__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Alphaproteobacteria; o__Rhizobiales; f__Rhizobiaceae; g__
concoct_M8_bin91 d__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Alphaproteobacteria; o__Sphingomonadales; f__Sphingomonadaceae; g__

ANI 分析

若 bins 基因组注释到属水平，可以尝试利用 fastANI 软件进一步细化到种级别的 ANI（average nucleotide identity）分析。一般同物种的 ANI 值在 95% 以上，当两菌间的 ANI ≤ 95% 时认为它们属于不同种。

表格 21  bins 物种 ANI 分析结果
Bin_ID Fastani_Reference Fastani_Taxonomy
maxbin2_M1_bin1 GCF_003952525.1 d__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Alphaproteobacteria; o__Rhizobiales; f__Rhizobiaceae
concoct_M8_bin51 GCA_003241875.1 d__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Alphaproteobacteria; o__Sphingomonadales; f__Sphingomonadaceae; g__Sphingomonas sp003241875

常见问题

Q1、从哪些序列下手进行 binning？

根据基于聚类的序列类型的不同，可分为 reads binning、contig binning 和 genes binning。

Q2、为什么选择宏基因组和 Binning 测序？

  1. 获得未培养的微生物基因信息；
  2. 同时获得物种的微生物群落结构和功能信息，分辨率达菌株水平；
  3. 获得单菌的基因组草图，对不同的物种进行分类鉴定；
  4. 三代测序可跨越复杂基因结构，组装更高质量、更完整的宏基因组；
  5. 为菌群的分类和功能描述提供更多的解决方案；
  6. 和其余组学联合分析，更容易挖掘深层数据，出高分文章。

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