BSR(Bulked Segregant RNA sequencing)是将转录组测序技术与集群分离分析方法相结合的新一代基因精细定位研究策略。通过在转录组范围内筛选与目的性状紧密连锁的SNPs,进行目的基因的精细定位,同时进行基于转录组测序的表达调控网络分析。
应用领域
1.分子标记辅助育种(MAS);
2.基因克隆。
选材要求
1.适用所有物种,尤其适用于重复序列高、基因组大、多倍体等基因组复杂的物种;
2.具有重要农艺性状个体构建的遗传群体(临时群体:F1、F2;永久群体:RIL、DH、NIL 等);
3.一般选择群体的5%到10%作为极端混池,原则上极端样品不少于30个,可以考虑在亲本测序时,选择特定时期,以便分析关联基因的差异表达。
测序方案
1.Hiseq测序平台,PE150;
2.推荐亲本测序量不低于6G Clean data,子代混池测序量不低于10G Clean data。
分析内容
1.测序数据质控:
2.转录组数据与参考基因组序列比对(无参进行亲本unigene库组装)
3.转录组文库质量评估
4.基因结构分析
5.新基因分析(针对有参物种)
6.基因表达量分析
7.BSR关联分析
8.候选区域可变剪接分析以及新基因分析(针对有参物种)
9.候选基因功能注释及富集分析(NR、Swissprot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG)
10.候选基因差异表达分析
11.候选区域差异表达基因功能注释
项目周期
2个月

1.定量统计基因型频率:利用二代测序技术,直接获得数字化信号;
2.高灵敏度:能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本;
3.任意物种的全基因组分析:不依赖物种基因信息,能够直接对任何物种进行转录组分析;
4.分析更优化:针对候选基因筛选添加更详细的分析内容;
5.性价比高:与人工筛选数百标记的总费用相当,却无需您投入大量的人力和时间。

1.样品类型:RNA;
2.样品浓度:50ng/μL;
3.样品总量:混池RNA总量≥3μg,个体RNA总量≥1μg;
4.样品纯度:OD260/280为1.8~2.2,OD260/230≥0.5,260nm处有正常峰值;
5.RNA完整性: 电泳检测28S/18S≥1.0(距最近的电泳结果)。


样品保存与运输
1.总RNA样品请溶于RNase-free H2O或乙醇中,置于1.5 ml RNase-free离心管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于装有干冰的50 ml带盖离心管(或其他固体支撑物)中,再将50 ml管放在封口袋中;
2.植物组织样品取样后用锡箔纸包裹并标注,立即液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中;植物组织如需全株提取请将整株组织样装入自封袋中,方便准确取样。动物组织、细胞或菌体取样后置于冻存管中并标注,立即液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中。请尽量使用新制备的样品且样品量至少满足3次以上提取(普通样品0.6g以上,RNA含量少的花、果实等组织需要加量送);
3.请将所有样品集中置于管、盒或袋中,以免散装导致样品的丢失;
4.总RNA或组织样品均使用足量的干冰运输,并且尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。如果条件许可,可在邮寄的箱子上下添加部分棉花,以保证尽量隔绝热量的传递。

使用BSR快速定位小麦抗条锈病基因Yr15

 

实验设计
材料为小麦抗感亲本杂交构建的F2群体,从F2群体中选择232个个体构建了6个RNA混池,混池大小分别为抗池R1 (70 individuals), R2 (67) and R3 (50) ,感池S1 (15 individuals), S2 (17) and S3 (13)。2个亲本和6个RNA混池进行测序开发SNP标记,测序后进行关联分析,定位小麦抗条锈病基因。
结果展示
1.由于小麦没有完整的基因组序列,本实验SNP发掘利用NCBI里公布的56954个UniGene库和94177个基因模式UCW库作为参考,数据过滤后,通过与这两个库的比对,最后在双亲之间分别获得66426和52262个可能的SNP位点,图1a显示了用以上不同的库进行SNP calling之后,得到的SNP在小麦不同基因组上数目统计;
2.利用SNP-index法对混池进行关联分析,在染色体1B上得到若干关联区域,其中一个区域在与Yr基因紧密连锁的标记R11附近,因此将该区域作为候选关联区域,结果如图1c所示;
3.通过混池中抗感SNP之比>6继续缩小关联区间,利用前人在2014年构建的遗传图谱对关联区域进行了验证结果如图1b所示。通过以上种种不同标准,最终将关联区间锁定在1B染色体的短臂靠近着丝粒的区间内,该区间包含175个SNP;

 

4.将得到的SNP反向验证后,最终利用28个SNP设计标记构建关联区域的遗传图谱和QTL定位,最终将小麦抗条锈病基因Yr锁定在标记R5和R8 0.77cM区域,且在群体中得到了验证如图2a和2b所示。

 

参考文献
Ramirez-Gonzalez, R. H. et al. RNA-Seq bulked segregant analysis enables the identification of high-resolution genetic markers for breeding in hexaploid wheat. Plant Biotechnol J 13, 613–624 (2015).

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