Mutmap是以二代测序技术为基础,通过对遗传分离群体中突变体子代混池和野生型亲本进行全基因组重测序, 然后把突变体群体测序结果与野生型基因组序列相比对, 找出造成突变体性状的基因及变异位点,是重测序BSA的一种。
应用领域
1. 功能基因定位;
2. 分子标记辅助育种(MAS)。
选材要求
1. 有参考基因组序列的物种;
2. 具有重要农艺性状的突变体材料(诱变剂诱导的点突变)构建的遗传群体(临时群体:F1、F2;永久群体:RIL、DH、NIL 等);
3 突变体混池规模:质量性状-不低于30个子代(混池越大,越有利于消除背景噪音);数量性状-推荐选取群体规模的5%-10%来构建混池,同时不低于30个子代。
测序方案
1. Hiseq平台,PE150;
2. 推荐突变体混池中每个子代测序深度≥1×,野生型亲本≥10× 。
分析内容
1. 测序数据质控;
2. 与参考基因组比对;
3. 变异结果检测和注释(SNP、InDel);
4. 关联分析
高质量SNP筛选
关联区域定位
关联区域内变异结果结构注释和功能注释(SNP/InDel)
关联区域基因功能注释(NR, SwissProt, GO, KEGG, COG, KOG, Pfam)
项目周期:2个月

1. 标记密度高:全基因组水平扫描变异位点(SNP、InDel);
2. 性价比更高:只测1个野生型亲本和1个突变体子代混池,降低成本,性价比更高;
3. 分析内容更优化:候选区域内的SNP注释,基因注释会更详细为您提供最可能的候选基因信息;
4. 定位结果更精确:候选SNP数目少,方便后续验证。

1. 样品类型:基因组DNA;
2. 样品浓度:≥30ng/μL;
3. 样品总量:单个混池DNA≥2ug,体积≥20ul;单个子代DNA≥1ug,体积≥10ul;亲本DNA≥2ug,体积≥20ul;
            组织样品≥1g;
4. 样品纯度:OD260/280为1.7~2.2;
5. 电泳要求:主带清晰,无降解或轻度降解(距送样日最近的电泳结果)。


样品保存与运输
1. 基因组DNA样品请仔细纯化,尽量避免污染,并请将所送样品保留备份;DNA样品置于1.5 ml无菌离心管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口;
2. 植物组织样品请尽量选用幼嫩新鲜的,取样后用锡箔纸包裹并标注,立即放入液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中。动物组织、细胞或菌体取样后置于冻存管中并标注,立即放入液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中。请尽量使用新制备的样品;
3. 请将所有样品集中置于管、盒或袋中,以免散装导致样品的丢失。在运输过程中,最好放在干冰中,时间不要超过72小时,如果利用冰袋运输,则时间最好不要超过24小时,尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。如果条件许可,可在邮寄的箱子上下添加部分棉花,以保证尽量隔绝热量的传递。

《Nature biotechnology》:MutMap 辅助水稻耐盐新品种的培育 

 

实验设计
本研究将野生型 "Hitomebore" 进行 EMS 诱变处理,产生耐盐突变体(hst1),以Hitomebore和hst1为亲本杂交构建F2群体,运用Mutmap 的方法,取20株F2分离群体中的耐盐性个体构建混池,与野生型亲本 一起进行全基因组重测序,关联分析定位水稻耐盐基因;同时对突变体和野生型(各3个生物学重复)分别进行转录组测序,通过寻找Mutmap定位区域内基因的差异表达,验证耐盐机理。
结果展示
1. Mutmap将水稻耐盐性状定位到6号染色体2.76-8.57M的区域,区域内有1个非同义SNP突变,使OsRR22基因中色氨酸突变为终止子。
2、研究中对突变体耐盐机理进行了验证,其中包含通过转录组测序的方法,证实耐盐突变体hst1和野生型在耐盐应答反应中有21个基因出现2倍以上的差异表达。
3、新耐盐品种的培育及推广:以突变体hst1为母本,野生型Hitomebore为回交父本,构建BC1F3群体,即Kaijin耐盐新品种,于2015年在当地推广。

 

参考文献
Abe A, Kosugi S, Yoshida K, et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap[J]. Nature biotechnology, 2012, 30(2): 174-178. 

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