对已有参考基因组序列的物种的所有作图群体,对亲本进行个体重测序,对某个极端性状材料混池测序,检测SNP,获得与性状紧密关联的分子标记和精细定位区域,是目前最高效的基因定位方法。

应用领域
1. 功能基因定位;
2. 分子标记辅助育种(MAS)。

选材要求
1. 有参考基因组序列的物种;
2. 具有重要农艺性状个体构建的遗传群体(临时群体:F1、F2;永久群体:RIL、DH、NIL 等);
3. 子代混池规模:质量性状-不低于30+30(混池越大,越有利于消除背景噪音);数量性状-推荐选取群体规模的5%-10%来构建混池,同时不低于30+30。

测序方案
1. Hiseq平台,PE150;
2. 推荐混池中每个子代测序深度≥1×,每个亲本≥10× 。

分析内容
1. 测序数据质控;
2. 与参考基因组比对;
3. 变异结果检测和注释(SNP、InDel);
4. 关联分析
高质量SNP筛选
关联区域定位
关联区域内变异结果结构注释和功能注释(SNP/InDel)
关联区域基因功能注释(NR, SwissProt, GO, KEGG, COG, KOG, Pfam)
项目周期:2个月

 

1.标记密度高:全基因组水平扫描变异位点(SNP、InDel);
2.定位更精细:同等混池规模的情况下,定位效果优于简化基因组测序;
3.分析内容更优化:候选区域内的SNP和基因注释会更详细为您提供最可能的候选基因;

1. 样品类型:基因组DNA;
2. 样品浓度:≥30ng/μL;
3. 样品总量:单个混池DNA≥2ug,体积≥20ul;单个子代DNA≥1ug,体积≥10ul;亲本DNA≥2ug,体积≥20ul;
            组织样品≥1g;
4. 样品纯度:OD260/280为1.7~2.2;
5. 电泳要求:主带清晰,无降解或轻度降解(距送样日最近的电泳结果)。


样品保存与运输
1. 基因组DNA样品请仔细纯化,尽量避免污染,并请将所送样品保留备份;DNA样品置于1.5 ml无菌离心管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口;
2. 植物组织样品请尽量选用幼嫩新鲜的,取样后用锡箔纸包裹并标注,立即放入液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中。动物组织、细胞或菌体取样后置于冻存管中并标注,立即放入液氮速冻,保存于液氮或超低温冰箱中。请尽量使用新制备的样品;
3. 请将所有样品集中置于管、盒或袋中,以免散装导致样品的丢失。在运输过程中,最好放在干冰中,时间不要超过72小时,如果利用冰袋运输,则时间最好不要超过24小时,尽量选用较快的邮递方式,以降低运输过程中样品降解的可能性。如果条件许可,可在邮寄的箱子上下添加部分棉花,以保证尽量隔绝热量的传递。

重测序BSA定位棉花短纤维性状

 

实验设计

 

 

结果展示
1.转录组测序,两个NIL亲本进行比对,统计存在非同义突变的SNP位点,将性状关联到D基因组13号染色体1M区域,17个基因
2. BSA结果:根据两个混池间非同义SNP个数,将性状定位到D基因组13号染色体的3M区域,转录组定位的结果包含在这3M区域内
3. 通过设计特异性引物,再次缩小定位区域,最终定位到6K的区域,该区域包含一个候选基因。

 

参考文献
Thyssen G N, Fang D D, Turley R B, et al. Next generation genetic mapping of the Ligon-lintless-2 (Li 2) locus in upland cotton (Gossypium hirsutum L.)[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2014, 127(10): 2183-2192.

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