全基因组甲基化测序分析

全基因组DNA甲基化水平图谱绘制

产品介绍

DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息，获得全基因组范围内所有C位点的甲基化水平数据，对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。Bisulfite甲基化测序是以新一代高通量测序平台为基础，结合全基因组Bisulfite处理和生物信息数据分析技术，进行低成本、高效率、高准确度的全基因组DNA甲基化水平图谱绘制。

分析内容流程

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结果展示

碱基类型分布

碱基类型分布检查用于检测有无AT、GC分离现象。若无bisulfite处理，高通量所测序列为基因组随机打断后的DNA片段，由于位点在基因组上的分布是近似均匀的，同时，G/C、A/T含量也是近似均匀的。全基因组甲基化项目中经过bisulfite处理后的基因组中大部分的C位点变成T位点，因此其中一条链出现T的含量增加而C的含量剧减，同时对应的反向链出现A的含量增加而G的含量减少。

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5mC检测

5mC的检测主要使用Bismark软件工具包实现。由于样品经过重亚硫酸处理，基因组上所有的未甲基化的C位点转换成了U；经过PCR扩增U->T;即基因组上未甲基化的C转化成了T；而原本甲基化的C；没有改变；相应的负链G->A;bismark是专门用于甲基化处理的比对软件；他会对reads进行转变；根据Clean Reads在参考基因组的最佳的比对结果，提取全基因组胞嘧啶（C）位点的比对碱基信息，最终得到5mC位点覆盖统计。

染色体水平甲基化分布图谱

在每条染色体上，以100K大小为一窗口来计算每个窗口的甲基化水平，继而从染色体水平描述甲基化 C 碱基的分布情况，绘制全基因组染色体水平甲基化图谱，可以很直观的呈现出染色体某个区域甲基化水平。

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高甲基化CGI区域注释

对高甲基化密度的CGI区域进行注释，区域甲基化水平大于0.7我们认为是高甲基化的CGI区域；同时我们把覆盖度大于5X的C位点认为是可信度较高的位点，去除CGI 区域内可信度较高的C位点的比例小于0.1的CGI区域；对剩下的区域进行注释；取基因上游3000bp为promoter区,进行overlap注释。

DMR相关GO基因分类注释

DMR相关基因GO注释分类统计图，直观的反映出在生物过程（biological process）、细胞组分（cellular component）
和分子功能（molecular function），所有基因和差异基因注释GO term的个数分布。可深入挖掘DMR相关基因的功能及所在的信号通路，筛选关注差异基因注释情况。

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DMR关联基因代谢通路分析

生物体内，某些基因位点受到甲基化修饰之后，会影响该基因的表达，从而改变生物学表型。因此，对DMR关联基因分别进行GO和KEGG注释及富集分析，有助于深入挖掘甲基化修饰引起的生物学功能变化。

成功案例

常见问题

1. 每个DMR区的片段长度不同是为什么？例如一个DMR长度将近1 kb，那这1 kb是怎么来的，这1 kb的任意一段是不是就不是DMR了？

答：.DMR是用Bisulfighter软件检测的，详细可以参考Bisulfighter的相关文献（Bisulfighter:accuratedetectionofmethylatedcytosinesanddifferentiallymethylatedregions）。DMR是差异甲基化区域，长度不固定，长度为1KB的DMR中的任意一段不一定是DMR，如果取得的任意一段没有甲基化的差异就不是DMR，如果有多个DMR连在一起，我们便将这些DMR合并成一个大的DMR。

2. 甲基化水平计算方法都有哪些？

答：甲基化水平计算方法共分四种：
1)单个位点甲基化水平：
单个位点的甲基化水平＝支持甲基化C的reads数/总的reads数
注： 对于参考基因组上的C位点，有些reads（reads上此位置处是C）支持此位点是甲基化的C位点，有些reads不支持(reads上此位置是T), 那么单个位点的甲基化水平就是支持甲基化的reads数/(支持甲基化的reads数＋不支持甲基化的reads数)
计算得到单个位点的甲基化水平后，我们用二项分布检验判断某位点是否为甲基化C位点。
用从左开始第二个C计算单个位点甲基化水平。
对于某个区域的甲基化水平计算方法，不同的方法会得到不同的结果。
2)区域甲基化水平计算方法1-Fraction of methylated cytosines
即：甲基化C占区域内所有覆盖到的C位点的比例
对于图片中的a:区域甲基化水平=10/12;b)甲基化水平＝11/12
3)区域甲基化水平计算方法2-Mean methylation level
即:所有C位点的平均甲基化水平，区域内所有甲基化的C的单个位点甲基化水平之和/区域内所有覆盖到的C位点的个数
a)甲基化水平＝(2/2+3/3+20/21+4/30+4/25+3/17+3/20+6/7+4/6+5/5)/12
b)甲基化水平＝(1/5+1/3+3/12+40/41+29/31+30/32+77/87+45/47+4/12+1/7+2/10)/12
4)区域甲基化水平计算方法3-Weighted methylation level
即：加权甲基化水平，区域内所有甲基化C位点总的reads数/区域内总的覆盖度
a)甲基化水平＝(2+3+20+4+4+3+3+6+4+5)/(2+3+21+30+25+17+20+7+6+5+18+25)
b)甲基化水平=(1+1+3+40+29+30+77+45+4+1+2)/(5+3+12+16+41+31+32+87+47+12+7+10

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